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操作流程 3

安全預防

• 當使用 qEV 柱時采取適當?shù)膫€人防護措施，比如實驗服,，手套和防護鏡,。

• 柱子的抗菌溶液包含 0.05% w/v 的疊氮化鈉。大量的疊氮化鈉有毒,，所以應該避免皮膚和眼睛的直接接觸。

• 廢棄緩沖液應妥善處理,。疊氮化鈉會在銅制管道中累積引起爆炸,。

• 生物樣品可能有危險，當使用 qEV 柱時,，請教實驗室安全員有關(guān)樣品安全操作的要點,。

保存

柱子保存在含有抑菌劑（例如 20 %乙醇，或<0.05 % w/v 的疊氮化鈉）的溶液中,，存放于+4到+8 °C,。抑菌劑可以在沖洗步驟時引入（見囊泡收集后部分）,。

使用前

如下圖所示：

• 將柱子固定,，使液面水平（確保柱子垂直）

• 不要移除底部滑動蓋

• 小心緩慢地移去頂蓋

柱子的平衡

• 移除底部滑動蓋，并且使用至少 10 mL 洗脫緩沖液（PBS）沖洗柱子,。如果不是使用PBS 洗脫,，那么至少使用 30 mL 洗脫緩沖液沖洗柱子。記下 5 ml 緩沖液通過尺寸排阻柱通過的時間,，這可用于判斷何時需要清洗柱子,。

• 確認有充分的平衡時間使柱子溫度介于操作溫度范圍內(nèi),。

• 不要使柱子變干。頂部的篩板必須保持濕潤,。柱子變干會影響其功能,。

• 使用當天新配的過濾（0.2 μm）緩沖液避免引入顆粒物污染,。

• 為了**的結(jié)果，建議購買 Izon Prep and Reagent 試劑盒,。

• 如果在操作溫度范圍之外使用，可能會得到錯誤的結(jié)果,。

樣品的純化

一.樣品的引入的應用

1. 在柱子移除底部滑動蓋之前，用移液槍移除篩板頂部的緩沖液,。

2. 加入 500 μL 樣品。

3. 立即移去底部滑動蓋,。

4. 立即開始收集 0.5 mL 餾分；

• *開始的六個餾分（3.0 mL）是空隙體積,，不包含囊泡,，通常無需分析。

• 建議將空隙體積收集在同一個收集管中來節(jié)約時間,，并可避免 6 個單獨的管子帶來的測量誤差,。

5. 當*后的樣品剛剛進入柱子頂部篩板（與之相平），加入更多的緩沖液,，但是不要高于頂部篩板 2 mL,。

• 等待直到*后一滴樣品剛剛進入柱子頂部篩板，避免樣品稀釋,。

二. 樣品餾分收集

當依據(jù)操作流程使用 qEV 柱時，EVs 大多數(shù)洗脫于餾分 7,、8 和 9 中,，去除了～99.8 %的蛋白；

大于 10 的餾分包含更多的蛋白和更少的囊泡,，不建議分析,。為了得到更高的 EV 回收率，餾分可以合并起來,，但是,，合并餾分會稀釋 EVs 的濃度,。

方法 A — 得到**的純度和濃度

不同的樣品會得到不同的洗脫峰形，因此建議預先測量 EV 濃度并對所有餾分（7 - 11）進行蛋白純化,。

1. 空隙體積之后立即收集 3 個囊泡餾分,，每個餾分 500 μL（餾分 7、8 和 9）,。

2. 測量每個餾分的 EV 濃度（使用 Izon qNano）和蛋白純度,。

• 為了得到高濃度囊泡，使用** EV 濃度的餾分（通常 7 和 8）,。注意：合并餾分會稀釋 EV 濃度,。

• 為了得到高純度囊泡，使用*低蛋白濃度的餾分,。

方法 B — 一般使用操作

空隙體積之后立即收集一個囊泡餾分,，1500μL。為了減少蛋白污染,，建議只收集 1000 μL,。

三. 囊泡收集后

當收集完囊泡餾分之后，用至少 10 mL 緩沖液沖洗柱子,，并按照《保存》部分的要求保存柱子,。記下 5 ml 緩沖液通過尺寸流過尺寸排阻柱所需要的時間，這對于檢測何時清洗柱子很有用,。流速的改變可能暗示柱子被堵住或被污染,。

qEV 柱的維護

再次使用

如何檢測柱子何時被污染并需要清潔；

• 流速相比初始流速開始變緩,。因此建議測量初始沖洗流速（和／或空隙體積）作為對比,。

• 如果較先前相似的樣品來說回收率明顯下降，那么期望的 EVs 產(chǎn)率也相應下降,。如果是這樣，使用 Izon CPC100 校正顆粒（稀釋于 PBS 緩沖溶液中）,，收集餾分并使用qNano 測量至少 2000 個數(shù),。兩個峰值餾分的回收率應該>50%。

• 在沖洗完后,，柱子頂端有顏色的變化,。

注意

• 對于新的柱子和干凈或再生的柱子，頂蓋和凝膠表面之間的空間說明儲存過程當中凝膠有所沉降,，并不影響其性能,。為了使

樣品的稀釋影響*小化，可以將頂蓋向下推動<2 mm,。

• 當囊泡餾分隨后被用于 PCR 或 RT-PCR 時,，建議柱子單次使用,。

柱子的再生

通常使用 20 到 30 mL 緩沖液清洗柱子，隨后使用新緩沖液平衡柱子（如果更換環(huán)境）,。在一些應用中,，變性的蛋白或脂質(zhì)不會在再生步驟中被洗脫下來?？梢酝ㄟ^下面的清洗步驟來去除,。

柱子的清洗

去除沉淀蛋白、非特異性吸附蛋白和脂蛋白用 10 mL 0.5 M NaOH 清洗柱子,，然后用至少 30到 50 mL 緩沖液沖洗柱子,，并檢查洗脫溶液pH。

去除強非特異性吸附蛋白,、脂蛋白和脂質(zhì)

用 20 mL 非離子型表面活性劑溶液,，如 0.1 %Triton X-100 清洗柱子，然后用至少 20 到 30mL 緩沖液沖洗柱子,。

在某些情況下,，一些樣品仍會殘留痕量蛋白。在清洗結(jié)束時再次檢查蛋白含量,，如果蛋白水平高于預期,，再清洗一次。

柱子的消毒

消毒可以**程度減少凝膠的微生物污染,。用10 mL 0.5 M NaOH 清洗柱子,。然后用 30 到 50mL 無菌緩沖液平衡柱子，并檢查洗脫溶液pH,。

注意

• 脫氣緩沖液有助于避免凝膠基質(zhì)中氣泡的產(chǎn)生,。少量的氣泡（<10）對柱效影響極小。

• 建議使用 0.15 M 或更高離子強度的緩沖液,，以避免溶質(zhì)與凝膠基質(zhì)之間產(chǎn)生不必要的離子相互作用,。

• 為了避免尺寸排阻柱的堵塞，建議過濾或低速離心生物樣品以去除大顆粒物,。

柱子的性能指標

囊泡的峰值洗脫

• 對于 500 μL 的樣品體積,，囊泡的洗脫峰值在 4.0 mL ± 0.5 mL。

• 兩個峰值餾分的回收率大約 50 %,。

• 對于 500 μL 的樣品,，峰值餾分通常在餾分 8 和 9 之中。如果希望更高的純度,，可以只收集*早的峰值餾分,。

通過測定 280 nm 處的紫外吸收可以得到 qEV柱的蛋白洗脫圖。通過 Bradford 法可以準確測定每個餾分中蛋白的精確含量。圖 1 展示了當500 μL 血漿樣品上樣至柱上時的囊泡洗脫圖,。每個餾分的囊泡濃度通過 qNano 測量,，蛋白含量通過 280 nm 處的吸收值來測量。

囊泡的富集是十分明顯,，它們主要存在于餾分7,、8 和 9 中。血清蛋白的洗脫更慢一些,，主要存在于餾分 11 - 30 中,。大于 10 的餾分通常含有高濃度的蛋白和低濃度的囊泡，不建議用來做分析,。

EVs 的洗脫始于餾分 7,，餾分 8 和 9 的濃度達到**。收集越多的餾分,，EVs 的總回收率越高,。

圖 2 血漿中 EVs 的回收率說明了這點。但是,，收集的餾分越多,，EV 的回收濃度就會越稀釋。見表 1,。

上樣體積

上樣體積越大,，囊泡餾分中的囊泡純度越低。圖 3 展示了血清上樣體積為 100 μL,，500 μL 和2000 μL 時的囊泡分布,。2000 μL 的樣品導致囊泡**程度地被蛋白污染。2000 μL 樣品中外泌體的出峰延遲顯而易見,。

為了得到更純的 qEV,，建議**的樣品體積為100 μL 至 500 μL，這樣囊泡會洗脫于餾分 7 至9 之中,。

圖 4 展示了血清上樣體積為 100 μL 和 500 μL 時的囊泡洗脫圖,。

囊泡的損失發(fā)生在當樣品體積大于 500 μL 時，囊泡的洗脫峰很寬以至于一些囊泡從餾分 11中被洗脫下來,。這些餾分不建議用來分析因為包含了大量的干擾蛋白,。

純化

圖 5 展示了餾分 7 到 9 之間含有很少量的蛋白，且越后面的餾分中蛋白含量越多,。

圖 6 展示了經(jīng)過 qEV 柱純化后，EVs 相對于蛋白的純化度,。每個餾分的純化因子（純化前后蛋白的減少比例）如圖所示,。餾分 7 和 8 富集的 EVs *多，也就是相對于回收的囊泡來說大部分蛋白被除去,。

qEV 柱純化過程中的稀釋

為研究 qEV 純化過程中對樣本的稀釋,，用已知濃度的聚苯乙烯納米顆粒標準品和脂質(zhì)體來模擬 EVs 的尺寸和組成,。

稀釋因子取決于哪些餾分被合并起來。起始體積為 500 μL 的聚苯乙烯納米顆粒標準品（直徑眾數(shù)為 400 nm）的總回收率為～100%,。

圖 7 說明合并餾分 5 至 11 可以得到 100%的顆?；厥章省＿@導致稀釋因子為 7,，并且收集的餾分含有大量的干擾蛋白,，因此不適于實際應用。

表 1 展示了收集不同餾分的稀釋因子以及回收率,。

雖然可以獲得 100％的回收率,，但是也可以通過測量每一個餾分的顆粒濃度，將濃度**的兩個餾分合并起來,。因此回收率與純度之間存在折衷,。當將餾分 7 和 8 合并起來時，脂質(zhì)體實驗的回收率為～50 %,，與聚苯乙烯納米顆粒的結(jié)果相一致,。

依據(jù) EVs 的*終濃度，可以不稀釋餾分,，直接用 qNano 來測量每個 餾 分 的濃度,。對于qNano，每分鐘 500 到 1600 個顆粒是**速率,。如果樣品速率高于這個范圍則需要進行稀釋,。

如果依據(jù)這個操作步驟來使用 qEV 柱，并且每個餾分的體積很精確的話,，EVs 會始終洗脫于餾分 7,、8 和 9，而餾分 10 和 11 中的含量很少,。

操作溫度

qEV 柱經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制,，流速大約 1 毫升/分鐘（±0.2 毫升/分鐘）。對于一些樣品來說,，操作溫度可能會影響流速,，*終影響 EVs的洗脫峰形。

回收率的優(yōu)化溫度為在 15 °C 和 25 °C 之間 ,，因此推薦的操作溫度為 15 - 25 °C ,。

大體積樣品的操作 4

對于一些生物流體來說， qEV 純化前,，可以通過將樣品預先濃縮來獲得更多的外泌體,。根據(jù)所使用的樣品和其它制備步驟，此操作步驟可以根據(jù)需要相應修改。

1）取定量的細胞培養(yǎng)液,，將樣品離心 1500 g,，10 分鐘，隨后離心 3000 g,，10 分鐘,，取上清液。對于細菌細胞來說,，則需要更高的離心力,。

2）用 Merck Millipore 離心裝置或等同的裝置來濃縮細胞培養(yǎng)液。Amicon Ultra 15 是一種 50mL Falcon 類型裝置,，需要很低的離心轉(zhuǎn)速,，*高 4000 g。這樣的話每次離心需要 15 分鐘,。這個裝置可以將 15 mL 液體濃縮至 300-500 μL,。

3）如果樣品中含有不溶物，在 qEV 純化前10,，000 g 離心 10 分鐘,，去除沉淀。否則這些沉淀會對后續(xù) TRPS 分析造成影響,。

4）樣品經(jīng)過以上濃縮便可以按照上面第二部分來進行 qEV 純化了,。樣品餾分收集見第 2 頁。

qEV 餾分的 TRPS 分析

對于 TRPS 分析來說,，Izon Science 推薦使用Izon 試劑盒,，這個試劑盒可以用來預涂納米孔并可以在整個操作過程中使用。

在 TRPS 的準備階段和操作階段中,，需要過濾所有試劑以避免污染或者大顆粒對 TRPS 濃度測試的干擾,。Izon Science 推薦使用當天新配的過膜（0.22 μm 注射器式濾器）試劑。

用 TRPS 分析 qEV 餾分時,，Izon Science 推薦將餾分在初始電解液稀釋 1/5 或 1/10,。優(yōu)化稀釋比例，使得**壓力下的通過速率為約每分鐘500-1600 個顆粒,，以避免納米孔堵塞,。

如果對于 TRPS 分析來說囊泡濃度過低，需要濃縮樣品（見下面）,。下面部分介紹 qEV 餾分收集后的樣品濃縮,。

qEV 餾分收集后的樣品濃縮

對于小體積樣品或?qū)τ谏?EVs 的樣品來說，濃縮囊泡可以使分析變得更簡單,。下面的方法可以在 0.5 - 1 h 之內(nèi)濃縮收集到的囊泡,。

通過 Merck Millipore Microcon-30 裝置濃縮小體積樣品（需要實驗室離心機達到 14,，000 g 的離心力）?？梢詫?0.5 mL 樣品濃縮至大約 200μL?？梢灾貜蜐饪s獲得更多的樣品（比如餾分7-9）,。

術(shù)語表

色譜：一種樣品中成分分離的方法。由固定相和流動相組成,，樣品的各組分在兩相之間分配,。固定相可以是固體，固體支持液體或凝膠,。固定相可被填充在柱中,，伸展為固定層或分布為薄膜。流動相可以是氣體或液體,。

柱體積：填充材料和空隙體積的體積和（可簡稱為床體積）,。

餾分：表示從柱上收集的特定體積，對于給定體積數(shù)值恒定,。也就是說,，餾分 7 的 0.5 毫升是指收集的 3.0 毫升至3.5 毫升中的 0.5 毫升。

脫氣：指將溶液抽真空來“煮”掉多余的溶解氣體,，如將燒瓶抽真空,。

流速：載液的體積流量，單位為 mL / min,。

空隙體積：柱中固定相的總體積,；柱子的其余部分由凝膠材料填充。它表示了 SEC 的排除體積,。

囊泡餾分：囊泡出現(xiàn)在的餾分,。

回收率：囊泡從柱子流出的量與進入柱子的量的百分比。