diSPIM是一種靈活和易于使用的實施選擇性平面照明顯微鏡（的SPIM），允許雙視圖（d樣品的）,，而安裝在一個倒置顯微鏡上（即SPIM的物鏡是直立）,。diSPIM由NIH / NIBIB和應(yīng)用科學(xué)儀器（ASI）的Hari Shroff實驗室共同開發(fā)。SPIM也稱為光片熒光顯微鏡或LSFM,，因為它使用光片或光平面垂直于成像方向照亮樣品,。
什么是SPIM或LSFM？
選擇性平面照明顯微鏡（SPIM）是一種快速而柔和的成像技術(shù),，將寬視野成像的速度與適度的光學(xué)切片和低的光漂白結(jié)合在一起,。它已成為重要的熒光成像方式，尤其是對于體積成像,。SPIM也稱為光片熒光顯微鏡（LSFM）或簡稱為“光片”,。 SPIM或LSFM的定義特征是從側(cè)面對焦平面進(jìn)行平面照明。在任何給定時間僅照亮樣品的一小部分,，從而使光損傷*小化,，并且提供光學(xué)切片，與寬視野落射熒光相比,，可以提高SNR,。由于以廣角（二維平行）方式收集圖像，因此,，光片成像比點掃描共聚焦顯微鏡要快得多,，點掃描共聚焦顯微鏡一次只能檢測一個像素。
光學(xué)薄片顯微鏡由于以下三個關(guān)鍵特性而迅速在體積成像中獲得普及：首先,，由于將激發(fā)限制在焦平面附近,，因此光損傷*小化，例如,，生物存活的時間更長,。第二，獲得良好的光學(xué)切片,，通常接近共聚焦顯微鏡,。第三，采集速度非?？?，比傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡快幾個數(shù)量級。 SPIM的主要缺點是,，需要額外的光學(xué)器件來生成光片,。*常見的是，將一個單獨的照明物鏡與檢測物鏡正交放置,，并將產(chǎn)生紙張的光學(xué)器件放置在該照明物鏡和激光源之間,。添加額外的鏡頭會給成像系統(tǒng)和樣品安裝帶來空間限制,。從本質(zhì)上講，顯微鏡需要圍繞樣品進(jìn)行設(shè)計,，因此存在各種各樣的光片顯微鏡設(shè)計,，每種設(shè)計都*適合不同的樣品和不同的安裝要求。相比之下,，傳統(tǒng)的共聚焦或落射熒光顯微鏡只有一條光路,，可以容納更多種類的樣品。換句話說,，SPIM的優(yōu)點是以任何單個工具的適用范圍更窄為代價的,。
方案
將兩個物鏡以直角放置在水平安裝在開放式培養(yǎng)皿中的樣品上方，每個物鏡與垂直方向成45度角,。從一個物鏡創(chuàng)建一個光片，并使用另一個物鏡對其進(jìn)行成像,。通過將光片移動通過樣品來收集一堆圖像,。對于某些應(yīng)用程序，單個視圖或堆棧中的3D信息就足夠了（iSPIM）,。對于雙視圖系統(tǒng),，兩個物鏡的作用相反，以從垂直方向收集另一個堆棧,，然后可以將兩個數(shù)據(jù)集進(jìn)行計算合并以生成具有各向同性分辨率的3D數(shù)據(jù)集（克服了通常的軸向分辨率差的問題從其他視圖獲取信息）,。因此，雙視圖diSPIM具有兩條（通常是對稱的）光路,，包括兩個掃描儀和兩個攝像頭。
diSPIM“頭”可以安裝在各種倒置顯微鏡上,，包括ASI的RAMM框架,。diSPIM系統(tǒng)可以從各種系統(tǒng)集成商處獲得。各種開源和專有軟件包可用于數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理,。不論所使用的系統(tǒng)集成商和軟件如何,，大多數(shù)底層顯微鏡硬件都是相同的。
diSPIM目標(biāo)的選擇是有限的,，因為它們必須共同聚焦而不互相碰撞,。diSPIM的*常用物鏡是40倍水浸物鏡，NA為0.8（Nikon CFI Apo 40XW NIR）,。奧林巴斯20x / 0.5物鏡是另一種可能性1）尼康10x / 0.3,。ASI和Special Optics共同開發(fā)了一種適用于diSPIM的透明組織物鏡,，該物鏡可以以平板形式或在12 mm球形包膜中對高達(dá)5 mm深的透明組織進(jìn)行成像,。單面系統(tǒng)（iSPIM）具有更大的靈活性,，因為照明物鏡可以是低NA長WD物鏡。 sCMOS相機(jī)*常用于SPIM成像,。配備了Hamamatsu Flash4,，Andor Zyla，PCO Edge和Photometrics Prime 95B相機(jī)的diSPIM系統(tǒng),。 ASI制造了緊湊的光纖耦合2D振鏡或“掃描儀”，它是系統(tǒng)的組成部分,。掃描儀的原始版本通過在一個軸上進(jìn)行快速掃描來創(chuàng)建光片，并使用另一個軸將光片移動通過樣品2）,。還提供帶有圓柱透鏡的掃描儀版本,，用于產(chǎn)生靜態(tài)光片。激發(fā)激光（或激光發(fā)射）的輸出被簡單地饋送到掃描儀中,。使用2×1光學(xué)開關(guān)或雙輸出激光發(fā)射非常有幫助,，這樣激發(fā)就可以全部引導(dǎo)到有源光路中的掃描儀。
對于需要環(huán)境控制的應(yīng)用,，diSPIM可以輕松地配備恒溫箱外殼和適當(dāng)?shù)脑O(shè)備，以保持樣品的存活和快樂,。 底部物鏡（倒置顯微鏡）通常具有較低的放大倍率物鏡和較便宜的用于定位樣品的照相機(jī),。可以輕松添加落射照明,。
優(yōu)勢
像其他光片技術(shù)一樣，diSPIM僅照亮聚焦平面,，因此是使活細(xì)胞和生物成像的理想選擇,，因為它**程度地減少了光漂白和光毒性效應(yīng)。與傳統(tǒng)或旋轉(zhuǎn)盤共焦系統(tǒng)相比,，軸向分辨率提高了約2倍,，光漂白減少了10倍以上，速度可與旋轉(zhuǎn)盤媲美,。查看與confocal的更詳細(xì)的比較,。 與許多其他光片實現(xiàn)相比，diSPIM的主要優(yōu)勢在于,，與倒置顯微鏡類似,，樣品的安裝非常簡單。*常見的是，將標(biāo)本放在24 x 50 mm的蓋玻片上,，蓋玻片固定在一個特殊的腔室中,，該腔室可容納浸漬介質(zhì)。具有開放式安裝的其他燈片實現(xiàn)不具有各向同性分辨率,。查看光片法的更詳細(xì)比較,。 除了方便定位樣品外，底部物鏡還可用于光操縱（包括光遺傳學(xué)）或其他實驗技術(shù),。它也可以用來提供樣本的第三張獨立視圖,。這種靈活性也是diSPIM的獨特優(yōu)勢。 diSPIM是一種模塊化顯微鏡,，因此可以根據(jù)您的特定需求進(jìn)行多種變化和添加。NIH研究人員,，Applied Scientific Instrumentation等正在探索各種新功能和改進(jìn),。請參閱部分變體列表。 diSPIM系統(tǒng)可從多個系統(tǒng)集成商處購買,。與其他商用輕型薄板解決方案相比,，它們便宜且靈活。與定制的SPIM / LSFM系統(tǒng)相比,，它們易于獲取,，使用和維護(hù)。另請參見SPIM技術(shù)的更完整的技術(shù)比較,。
配置
ASI提供了所有必要的硬件來實現(xiàn)diSPIM,，這是一種靈活且易于使用的選擇性平面照明顯微鏡（SPIM）實現(xiàn)，可在安裝在倒置（i）上的情況下實現(xiàn)樣品的雙視圖（d）,。顯微鏡,。diSPIM“頭”可以安裝在各種倒置顯微鏡上，包括ASI的RAMM框架,。 ASI制造光機(jī)械元件,，包括電動平臺，用于創(chuàng)建和移動光片的2D振鏡,，以及壓電物鏡移動器。需要物鏡,，激光和照相機(jī)來完成系統(tǒng),；用戶可以自己購買其他物品，使用出售diSPIM的各種系統(tǒng)集成商的服務(wù),，或通過ASI購買它們,。 diSPIM已在蓋玻片上培養(yǎng)的細(xì)胞，嵌入在學(xué)院凝膠上的細(xì)胞c上成功進(jìn)行了測試。線蟲和斑馬魚的胚胎,，以及許多其他樣本,。
單面系統(tǒng)（iSPIM）
從一個物鏡創(chuàng)建并使用另一物鏡成像的光片。通常通過使用掃描儀（galvo）移動光片,，使光片穿過樣品,，該掃描器與移動成像物鏡的壓電平臺同步。
雙面系統(tǒng)（diSPIM）
雙方都有光片掃描儀,，壓電物鏡定位器和相機(jī)。在實驗過程中,，從兩個視圖中都收集了一堆圖像,，并且可以將兩個數(shù)據(jù)集進(jìn)行計算合并以生成具有各向同性分辨率的3D數(shù)據(jù)集（另一個視圖中的信息克服了通常的軸向分辨率差的問題）。如果需要,，可以單面模式運行,。
優(yōu)勢：XY和Z分辨率都非常好–結(jié)合了速度和分辨率，這是活細(xì)胞成像所無法比擬的,。
缺點：需要購買更多的硬件,。各向同性分辨率所需的數(shù)據(jù)后處理。
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ASI光片熒光顯微鏡diSPIM的工作原理介紹,？
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