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FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)
FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)

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FKM(Fluorescence Kinetic Microscope)多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)是目前功能*為強(qiáng)大全面的植物顯微熒光研究儀器,,是基于FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的顯微成像定制系統(tǒng)。它由包含可擴(kuò)展部件的增強(qiáng)顯微鏡,、高分辨率CCD相機(jī),、激發(fā)光源組、光譜儀,、控溫模塊以及相應(yīng)的控制單元和專用的工作站與分析軟件組成,。它不僅可以進(jìn)行微藻,、單個細(xì)胞、單個葉綠體乃至基粒-基質(zhì)類囊體片段進(jìn)行Fv/Fm、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng),、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應(yīng)曲線,、QA再氧化等各種葉綠素?zé)晒饧癕CF多光譜熒光(multicolor fluorescence)成像分析,;還能通過激發(fā)光源組進(jìn)行進(jìn)行任意熒光激發(fā)和熒光釋放波段的測量,從而進(jìn)行GFP,、DAPI,、DiBAC4、SYTOX,、CTC等熒光蛋白,、熒光染料以及藻青蛋白、藻紅蛋白,、藻膽素等藻類特有熒光色素的成像分析,;更可以利用光譜儀對各種熒光進(jìn)行光譜分析,區(qū)分各發(fā)色團(tuán)(例如PSI和PSII及各種捕光色素復(fù)合體等)并進(jìn)行深入分析,。

FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)使熒光成像技術(shù)真正成為光合作用機(jī)理研究的探針,,使科研工作者在藻類和高等植物細(xì)胞與亞細(xì)胞層次深入理解光合作用過程及該過程中發(fā)生的各種變化,為直接研究葉綠體中光合系統(tǒng)的工作機(jī)理提供了*為有力的工具,。FKM作為藻類/植物表型和基因型顯微研究的雙重利器,,得到了學(xué)界的廣泛認(rèn)可并取得了大量的科研成果。

功能特點

•內(nèi)置現(xiàn)今葉綠素?zé)晒庋芯康娜砍绦?,如Fv/Fm,、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng),、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應(yīng)曲線,、QA再氧化等,,可獲得70余項參數(shù)。

•配備10倍,、20倍,、40倍、63倍和100倍專用生物熒光物鏡,,可以清晰觀測到葉綠體及其發(fā)出的熒光,。

•激發(fā)光源組中包括紅外光、紅光,、藍(lán)光,、綠光、白光,、紫外光和遠(yuǎn)紅光等,,通過紅藍(lán)綠三色光還可以調(diào)出可見光譜中的任何一種色光,能夠研究植物/藻類中任何一種色素分子或發(fā)色團(tuán),。

•可進(jìn)行GFP,、DAPI、DiBAC4,、SYTOX,、CTC等熒光蛋白、熒光染料的成像分析

•高分辨率光譜儀能夠深入解析各種熒光的光譜圖,。

•控溫系統(tǒng)可以保證實驗樣品在同等溫度條件下進(jìn)行測量,,提高實驗精度,也可以進(jìn)行高溫/低溫脅迫研究,。

應(yīng)用領(lǐng)域

• 微藻,、大型藻類/高等植物的單個細(xì)胞、單個葉綠體,、基粒-基質(zhì)類囊體片段等的顯微結(jié)構(gòu)植物光合生理研究

• 藻類/植物逆境研究

• 生物和非生物脅迫的研究

• 藻類/植物抗脅迫能力及易感性研究

• 突變體篩選及光合機(jī)理研究

• 藻類長勢與產(chǎn)量評估

• 藻類特有色素與光合作用關(guān)系

• 藻類/植物——微生物交互作用研究

• 藻類/植物——原生動物交互作用研究

• 基因工程與分子生物學(xué)研究

測量樣品

• 植物活體切片

• 植物表皮

• 植物細(xì)胞

• 綠藻,、藍(lán)藻等各種單細(xì)胞和多細(xì)胞微藻

• 葉綠體提取液

• 類囊體提取液

• 含有葉綠體的原生動物

工作原理

FKM分析過程中,通過連接在顯微鏡上的激發(fā)光源組和內(nèi)置在6位濾波輪中的一系列濾波器,、分光鏡激發(fā)植物樣品中各種發(fā)色團(tuán)的動態(tài)熒光,。樣品激發(fā)出的熒光經(jīng)顯微鏡放大后進(jìn)行熒光光譜分析和熒光動力學(xué)成像分析。SM 9000光譜儀通過光纖與顯微鏡連接,,以進(jìn)行激發(fā)熒光光譜分析,。安裝在顯微鏡頂部的高分辨率CCD相機(jī)則用于熒光動力學(xué)成像分析。全部工作過程通過工作站和控制單元按照預(yù)先設(shè)定好的程序自動進(jìn)行。測量過程中,,可通過溫控模塊調(diào)控藻類,、植物細(xì)胞等實驗樣品的溫度。蠕動泵可以實現(xiàn)培養(yǎng)藻類的連續(xù)測量,。

儀器組成

1. 增強(qiáng)顯微鏡

2. 高分辨率CCD相機(jī)

3. 激發(fā)光源組

4. SM 9000光譜儀

5. 主控制單元

6. 工作站及軟件

7. 控溫模塊的控制單元

8. 6位濾波輪

技術(shù)參數(shù)

• 測量參數(shù)

?Fo,, Fo’, Fs,, Fm,, Fm’, Fp,, FtDn,, FtLn,, Fv,, Fv'/ Fm', Fv/ Fm ,,F(xiàn)v',,F(xiàn)t,ΦPSII,, NPQ_Dn,, NPQ_Ln, Qp_Dn,, Qp_Ln,, qN, qP,,QY,, QY_Ln, Rfd,, ETR等50多個葉綠素?zé)晒鈪?shù),,每個參數(shù)均可顯示2維熒光彩色圖像

?OJIP快速熒光曲線:測定分析OJIP曲線與二十幾項相關(guān)參數(shù)包括:Fo、Fj,、Fi,、P或Fm、Vj,、Vi,、Mo、Area ,、Fix Area,、Sm 、Ss 、N(QA還原周轉(zhuǎn)數(shù)量),、Phi???_Po ,、Psi_o 、Phi_Eo,、Phi_Do,、Phi_pav、ABS/RC(單位反應(yīng)中心的吸收光量子通量),、TRo/RC(單位反應(yīng)中心初始捕獲光量子通量),、ETo/RC(單位反應(yīng)中心初始電子傳遞光量子通量)、DIo/RC(單位反應(yīng)中心能量散失),、ABS/CS(單位樣品截面的吸收光量子通量),、TRo/CSo、RC/CSx(反應(yīng)中心密度),、PIABS(基于吸收光量子通量的“性能”指數(shù)或稱生存指數(shù)),、PIcs(基于截面的“性能”指數(shù)或稱生存指數(shù))等(選配)

?GFP、DAPI,、DiBAC4,、SYTOX、CTC等熒光蛋白和熒光染料的成像分析(選配)

?QA再氧化動力學(xué)曲線(選配)

?Spectrum熒光光譜圖(選配)

•具備完備的自動測量程序(protocol),,可自由對自動測量程序進(jìn)行編輯

?Fv/Fm:測量參數(shù)包括Fo,,F(xiàn)m,F(xiàn)v,,QY等

?Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng):Fo,,F(xiàn)p,F(xiàn)v,,F(xiàn)t_Lss,,QY,Rfd等熒光參數(shù)

?熒光淬滅分析:Fo,,F(xiàn)m,,F(xiàn)p,F(xiàn)s,,F(xiàn)v,,QY,ΦII,,NPQ,,Qp,Rfd,,qL等50多個參數(shù),,2套制式程序

?光響應(yīng)曲線LC:Fo,,F(xiàn)m,QY,,QY_Ln,,ETR等熒光參數(shù)

?Dyes & FPs穩(wěn)態(tài)熒光成像測量

?OJIP快速熒光動力學(xué)分析:Mo(OJIP曲線初始斜率)、OJIP固定面積,、Sm(對關(guān)閉所有光反應(yīng)中心所需能量的量度),、QY、PI等26個參數(shù)(選配)

?QA再氧化動力學(xué)(選配)

?Spectrum熒光光譜分析(選配)

•熒光激發(fā)光源:紅外光,、紅光,、橙光、藍(lán)光,、綠光,、白光、紫外光等可選,,根據(jù)客戶要求定制光源組

•透射光源(選配):白光,、遠(yuǎn)紅光

?高分辨率TOMI-2 CCD傳感器:

?逐行掃描CCD

?**圖像分辨率:1360×1024像素

?時間分辨率:在**圖像分辨率下可達(dá)每秒20幀

?A/D 轉(zhuǎn)換分辨率:16位(65536灰度色階)

?像元尺寸:6.45μm×6.45μm

?運行模式:1)動態(tài)視頻模式,用于葉綠素?zé)晒鈪?shù)測量,;2)快照模式,,用于GFP等熒光蛋白和熒光染料測量

?通訊模式:千兆以太網(wǎng)

•顯微鏡:Axio Imager M2,,可選配Axio Scope A1簡潔版或Axio Imager Z2高級版

?物鏡轉(zhuǎn)盤:研究級7孔自動物鏡轉(zhuǎn)盤

?透射光快門

?聚光器 Achr Apl 0.9 H

?6位反光鏡轉(zhuǎn)盤

?雙目鏡筒(100:0/30:70/0:100)

?機(jī)械載物臺:75×50mm,,硬膜陽極氧化表面

?樣品架:76×26mm

•物鏡:10倍、20倍,、40倍,、63倍和100倍專用生物熒光物鏡(可選)

•6位濾波輪:葉綠素?zé)晒狻FP/SYTOX,、DAPI/CTC等

•SM9000光譜儀

?入射狹縫:70μm×1400μm

?光柵:平場型校正

?光譜范圍:200-980nm

?波長**精確度:<0.5nm

?再現(xiàn)性:<0.1nm

?溫度漂移:<0.01nm/K

•溫度調(diào)控模塊:溫度調(diào)節(jié)范圍 5℃-70℃,,精確度0.1℃

•蠕動泵(選配):流速10-5600μl/min,用于藻類連續(xù)培養(yǎng)測量

•FluorCam葉綠素?zé)晒獬上穹治鲕浖δ埽壕週ive(實況測試),、Protocols(實驗程序選擇定制),、Pre–processing(成像預(yù)處理)、Result(成像分析結(jié)果)等功能菜單

•客戶定制實驗程序協(xié)議(protocols):可設(shè)定時間(如測量光持續(xù)時間,、光化學(xué)光持續(xù)時間、測量時間等),、光強(qiáng)(如不同光質(zhì)光化學(xué)光強(qiáng)度,、飽和光閃強(qiáng)度、調(diào)制測量光等),,具備專用實驗程序語言和腳本,,用戶也可利用Protocol菜單中的向?qū)С绦蚰0孀杂蓜?chuàng)建新的實驗程序

•自動測量分析功能:可設(shè)置一個實驗程序(Protocol)自動無人值守循環(huán)成像測量,重復(fù)次數(shù)及間隔時間客戶自定義,成像測量數(shù)據(jù)自動按時間日期存入計算機(jī)(帶時間戳)

•快照(snapshot)模式:通過快照成像模式,,可以自由調(diào)節(jié)光強(qiáng),、快門時間及靈敏度得到清晰突出的植物樣本穩(wěn)態(tài)熒光和瞬時熒光圖片

•成像預(yù)處理:程序軟件可自動識別多個植物樣品或多個區(qū)域,也可手動選擇區(qū)域(Region of interest,,ROI),。手動選區(qū)的形狀可以是方形、圓形,、任意多邊形或扇形,。軟件可自動測量分析每個樣品和選定區(qū)域的熒光動力學(xué)曲線及相應(yīng)參數(shù),樣品或區(qū)域數(shù)量不受限制(>1000)

•數(shù)據(jù)分析模式:具備“信號計算再平均”模式(算數(shù)平均值)和“信號平均再計算”模式,,在高信噪比的情況下選用“信號計算再平均”模式,,在低信噪比的情況下選擇“信號平均再計算”模式以過濾掉噪音帶來的誤差

•輸出結(jié)果:高時間解析度熒光動態(tài)圖、熒光動態(tài)變化視頻,、熒光參數(shù)Excel文件,、直方圖、不同參數(shù)成像圖,、不同ROI的熒光參數(shù)列表等

葉綠素?zé)晒馀c光譜分析結(jié)果

典型應(yīng)用:

產(chǎn)地:捷克

參考文獻(xiàn):

1.Küpper H,, et al. 2019. Analysis of OJIP Chlorophyll Fluorescence Kinetics and QA Reoxidation Kinetics by Direct Fast Imaging. Plant Physiology 179: 369-381

2.Konert G, et al. 2019. Protein arrangement factor: a new photosynthetic parameter characterizing the organization of thylakoid membrane proteins. Physiologia Plantarum 166: 264-277.

3.Exposito-Rodriguez M,, et al. 2017. Photosynthesis-dependent H2O2 transfer from chloroplasts to nuclei provides a high-light signalling mechanism. Nature Communications, 8: 49

4.Higo S,, et al. 2017. Application of a pulse-amplitude-modulation (PAM) fluorometer reveals its usefulness and robustness in the prediction of Karenia mikimotoi blooms: A case study in Sasebo Bay, Nagasaki,, Japan. Harmful Algae, 61:63-70

5.Jacobs M,, et al. 2016. Photonic multilayer structure of Begonia chloroplasts enhances photosynthetic efficiency. Nature Plants, doi:10.1038/nplants.2016.162

6.Andresen E,, et al. 2016. Cadmium toxicity investigated at the physiological and biophysical levels under environmentally relevant conditions using the aquatic model plant Ceratophyllum demersum. New Phytol.,, 210(4):1244-1258

7.Thomas G,, et al. 2016. Deficiency and toxicity of nanomolar copper in low irradiance—A physiological and metalloproteomic study in the aquatic plant Ceratophyllum demersum. Aquatic Toxicology,, 177:226-236

8.Fujise L, et al. 2014. Moderate Thermal Stress Causes Active and Immediate Expulsion of Photosynthetically Damaged Zooxanthellae (Symbiodinium) from Corals. PLOS ONE,, DOI:10.1371/journal.pone.0114321

9.Gorecka M,, et al. 2014. Abscisic acid signalling determines susceptibility of bundle sheath cells to photoinhibition in high light-exposed Arabidopsis leaves. Philosophical Transactions of the Royal Society B,, 369(1640), DOI: 10.1098/rstb.2013.0234

10.Mishra S,, et al. 2014. A different sequence of events than previously reported leads to arsenic-induced damage in Ceratophyllum demersum L. Metallomics,, 6: 444-454

11.Ferimazova N, et al. 2013. Regulation of photosynthesis during heterocyst differentiation in Anabaena sp. strain PCC 7120 investigated in vivo at single-cell level by chlorophyll fluorescence kinetic microscopy. Photosynthesis Research,, 116(1): 79-91

12.Andresen E, et al. 2013. Effects of Cd & Ni toxicity to Ceratophyllum demersum under environmentally relevant conditions in soft & hard water including a German lake. Aquatic Toxicology. 142–143,, 15: 387–402

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