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3D Nanoimaging

三維納米成像（3D Nanoimaging）和單分子跟蹤系統(tǒng)（升級(jí)Olympus 共焦顯微鏡）

Overview

在過(guò)去的幾年里，人們已經(jīng)設(shè)計(jì)了幾種方法來(lái)使用光學(xué)顯微鏡（STED,，PALM,，STORM）獲得具有納米分辨率的細(xì)胞特征圖像。這些方法雖然功能強(qiáng)大,，但在檢測(cè)圖像中稀疏的納米結(jié)構(gòu)時(shí)效率很低,。同時(shí)，它們也不足以探測(cè)納米級(jí)三維結(jié)構(gòu)中亞秒級(jí)的化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué),，這些結(jié)構(gòu)是不斷移動(dòng)和改變形狀的,。

在納米成像方法達(dá)到超分辨率的情況下，激光束不會(huì)像光柵圖像那樣按照預(yù)定的模式掃描樣品,。相反,，激光掃描成像基于反饋算法，在掃描過(guò)程中,，根據(jù)待成像物體的形狀連續(xù)地調(diào)整和確定激光束跟隨的路徑,。該算法將激光光斑移動(dòng)到離物體表面一定距離的位置，由于激光光斑的位置和離物體表面的距離是已知的參數(shù),，所以利用這些參數(shù)來(lái)重建物體的形狀,。

三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)可以在幾秒鐘內(nèi)分辨率達(dá)到20-40納米，精度為2納米,。

How it work?

使用SMT（Single-Molecule Tracking）納米成像的操作順序很簡(jiǎn)單：首先,，獲取感興趣區(qū)域的共焦圖像；然后,，用戶(hù)識(shí)別要成像的對(duì)象,。SMT納米成像通過(guò)開(kāi)關(guān)激活，激光束位于距離物體中心100-200納米的位置,。當(dāng)激光光斑接近待成像表面時(shí),，熒光量增加。然而,，熒光強(qiáng)度的增加取決于距離以及熒光團(tuán)的濃度和它們各自的量子產(chǎn)率,。為了將距離效應(yīng)與濃度效應(yīng)分開(kāi)，點(diǎn)的位置被迫垂直于表面振蕩。也就是說(shuō),，熒光強(qiáng)度在振蕩過(guò)程中發(fā)生變化（圖1）,。

Figure 1. 調(diào)制跟蹤技術(shù)示意圖。束點(diǎn)圍繞物體以圓形軌道運(yùn)動(dòng),，其與物體表面的距離以設(shè)定的頻率周期性地變化,；通常，對(duì)于每個(gè)軌道,，振蕩次數(shù)在8到32之間,，取決于物體的大小。這些半徑的小振蕩被用來(lái)計(jì)算軌道的調(diào)制函數(shù),，從中可以確定光斑與表面的距離,。

調(diào)制函數(shù)定義為由于表面的局部熒光而使交替部分與平均部分之比。實(shí)際上,，調(diào)制是PSF的空間導(dǎo)數(shù)與強(qiáng)度的比值,。調(diào)制函數(shù)隨著離表面距離的函數(shù)呈準(zhǔn)線性增加，這一特性允許它用于確定沿軌道激光光斑離表面的距離,。通過(guò)這種方法,，計(jì)算并重建物體的橫向形狀。

下面是納米成像單元及其與FV1000共焦顯微鏡的連接示意圖,。開(kāi)關(guān)盒允許用戶(hù)在標(biāo)準(zhǔn)操作模式下操作FV1000,，或激活納米成像系統(tǒng)。在納米成像操作中,，FV1000的振鏡通過(guò)國(guó)際空間站提供的電子設(shè)備進(jìn)行控制,。該信號(hào)由FV1000的內(nèi)部探測(cè)器收集并轉(zhuǎn)移到ISS光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采集單元。使用FV1000的振鏡在XY平面上跟蹤分子,，并通過(guò)壓電控制級(jí)在z軸上跟蹤分子,。儀表控制、數(shù)據(jù)采集和顯示在單獨(dú)的計(jì)算機(jī)上完成,。

右側(cè)部分包括儀器組件（PC,、控制電子設(shè)備、掃描儀和激光發(fā)射器）,。示意圖的左側(cè)部分包括ISS隨升級(jí)包提供的組件.

可參看文獻(xiàn)：

Nanometer-scale Imaging by the Modulation Tracking Method

Lanzano， L.,， Digman,， M.A.， Fwu， P.,， Giral,， H.， Levi,， M.,， Gratton， E.

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Measurement of Distance with the Nanoscale Precise Imaging by Rapid Beam Oscillation Method

Lanzano,， L.,， Gratton， E.

Microsc Res Tech,， 2012,， 75(9)， 1253-64.

Real-time Multi-Parameter Spectroscopy and Localization in Three-Dimensional Single-Particle Tracking

Hellriegel,， C.,， Gratton， E.

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Real-time Nanomicroscopy Via Three-Dimensional Single Particle Tracking

Katayama,， Y.,， Burkacky， O.,， Meyer,， M.， Bráuchle,， C.,， Gratton， E.,， Lamb,， D.C.

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Distance Measurement by Circular Scanning of the Excitation Beam in the Two-Photon Microscope

Kis-Petikova， K.,， Gratton,， E.

Microsc Res Tech， 2004， 63(1),， 34-49.