掃描電鏡制樣方法｜5種常用的生物樣品干燥方法

掃描電鏡在觀察生物樣品時,，具有以下特點：多角度觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)；不需要將樣品切成薄片,；景深大,、圖像立體感強；放大倍數(shù)從幾十倍到幾十萬倍連續(xù)可調(diào),；在觀察形貌的同時可以對微區(qū)的成分進行定量和定性分析,。而能否獲得真實、清晰,、理想的掃描電鏡觀察結(jié)果,，樣品的制備過程是關(guān)鍵。

生物樣品含水直接觀察,，會對掃描電鏡造成以下影響：

1. 樣品蒸發(fā)的水蒸氣遭遇高能電子束,，會被電離而放電,，引起束流大幅度波動,，使圖像模糊，或者根本不能成像;

2. 大多數(shù)含水樣品在高真空中容易發(fā)生形態(tài)損傷,，表面皺縮,、變形;

3. 樣品揮發(fā)會造成鏡頭、光闌等的污染;

4. 燈絲會被上升水蒸氣氧化而變質(zhì),。

生物樣品的含水量高,，二次電子產(chǎn)率低，導電性差,，對熱,，電子束敏感，僅有少數(shù)樣品如毛發(fā),、牙齒以及含水量極低的昆蟲等可以直接噴鍍觀察,，絕大多數(shù)的生物樣品均要求經(jīng)過干燥處理才能鍍金觀察,。

干燥是掃描電鏡生物樣品制備中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如果處理不好,，會直接影響到觀察的清晰度與準確度,。要想制備出好的掃描電鏡生物樣品，需要在干燥過程中盡可能減少由于水分蒸發(fā)而引起的樣品表面形貌的形變,，且必須確保干燥徹底,。大多數(shù)動植物容易發(fā)生明顯的塌陷和變形。因此,，需要針對不同的生物樣品來選擇合適的干燥方法,。

掃描電鏡生物樣品制備常用干燥方法

01 自然干燥法

自然干燥法是指樣品中的水分在大氣中自然蒸發(fā)，或樣品經(jīng)脫水處理后脫水劑自然揮發(fā)而干燥的方法,。

對干種子,、果殼、某些干花粉,、昆蟲標本等來說,，自然干燥法是一個簡易實用有效的方法，雖然在自然干燥過程中,，樣品體積有所收縮,，但卻保留了樣品的基本形態(tài)。適用于外表堅硬的樣品,，如外表有殼的昆蟲,，木材等。

自然風干——飛納掃描電鏡直接觀察螨蟲

02 烘干干燥法

烘干干燥法是將要研究的樣品用烘干箱烘干,，一般溫度控制在 80℃ 以下,，烘干程度以含水量在 5% 以下為好。此方法的干燥速度較快,，但水分蒸發(fā)時可能造成樣品變形或斷裂,。適用于不易變形且耐熱的樣品，比如淀粉粒,、孢子粉等,。

烘干的花粉噴金后直接可以用二次電子觀察

03 臨界點干燥法

臨界點干燥法是利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)下，液體和氣體的密度相等,，氣液界面完全消失,，液體的表面張力系數(shù)為零。臨界點干燥法之所以一直被視為制作生物醫(yī)學掃描樣品最可靠的干燥方法,，是因為此法能消除液體表面張力的作用,，干燥出的樣品能較大程度地保存其自然形態(tài)。

04 冷凍干燥法

冷凍干燥法是將含水樣品放入低溫環(huán)境中冷凍，或使用溶劑將樣品中的水逐級替換后冷凍,，然后抽真空升華,。它是利用低溫和真空，使樣品中的水分或溶劑直接升華,，以達到干燥樣品的目的,。冷凍干燥過程不經(jīng)過液相階段，因而避免了氣相和液相之間表面張力對樣品的損傷,。

05 真空干燥法

真空干燥法指的是將經(jīng)脫水（多用梯度脫水）的樣品置于真空容器中進行干燥的方法,。真空干燥法選用高熔點的有機溶劑（叔丁醇、乙腈,、六甲基二硅胺烷,、正丁醇等）作升華介質(zhì)，既保留了冷凍干燥法的優(yōu)點,，又不用對樣品進行冷凍處理,，無冷凍損傷，且操作簡單,。適用于所有生物樣品,，特別是細菌、細胞等微小樣品,。

經(jīng)過梯度脫水真空干燥的桿菌可以輕松獲得高倍圖像

小結(jié)

干燥方法在不斷改進,，但還是只能把由干燥引起的樣品變形控制在一定的范圍內(nèi)。上述 5 種干燥方法各有優(yōu)缺點,，且各有適用的生物樣品種類,。我們在選擇生物樣品干燥的方法時，盡量選擇能保持樣品表面真實結(jié)構(gòu)的方法,，在保證掃描電鏡狀態(tài)下,，盡量還原樣品表面細節(jié)。

對于生物樣品,，飛納電鏡低真空模式可以直接觀察一些生物樣品,，如新鮮植物葉片，昆蟲等,。觀察葉子氣孔,，高亮度的 CeB6 燈絲可以在低曝光時間下快速拍照,，獲得高質(zhì)量圖像,，避免了長時間曝光導致氣孔關(guān)閉以及長時間抽真空導致葉片失水收縮。