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表面等離子共振顯微鏡SPRm 200
2017年R&D100獲獎(jiǎng)產(chǎn)品
表面等離子體共振(SPR)是一種廣泛用于研究生物分子結(jié)合的免標(biāo)記檢測(cè)技術(shù),。 從90 年代商品化以來,，SPR 在儀器的發(fā)展和應(yīng)用層面上已日臻完善，并成為在生物醫(yī)學(xué)、傳感器研發(fā),、藥物開發(fā)等領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)之一,。近年來與SPR 相關(guān)的*重大的突破就是表面等離子體共振顯微鏡技術(shù)（SPRM）的出現(xiàn)。 SPRM 將高分辨顯微鏡成像與表面等離子體共振相結(jié)合,，充分利用了前者的空間成像和后者實(shí)時(shí)測(cè)量親和力和動(dòng)力學(xué)的功能,。用傳統(tǒng)的SPR 研究膜蛋白和待篩選的藥物和其他配體的相互作用是有難度的，這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)方法需要繁瑣地提取細(xì)胞中的蛋白,，并將純化過的蛋白固定在芯片表面,。 這樣多步的程序不但耗費(fèi)人力，而且改變了蛋白在細(xì)胞膜中所處的環(huán)境,。SPRM 由于可以直接在芯片上固定或培養(yǎng)細(xì)胞,，因此可以無需提取細(xì)胞中的蛋白，就可在原位研究其結(jié)合過程,。另外,，每一細(xì)胞上膜蛋白局部和整體的結(jié)合都可以測(cè)定和觀察到。
SPRM 模式 (高分辨顯微技術(shù)) 集成光學(xué)顯微鏡與SPR技術(shù)
SPRM 是一種基于高分辨成像技術(shù)的SPR 檢測(cè)模式,。它同時(shí)對(duì)芯片表面提供明場光學(xué)圖像和親和力和動(dòng)力學(xué)常數(shù),。獲得的圖像中的每個(gè)像素都可提供一個(gè)傳感譜圖，因此可以對(duì)芯片表面的各個(gè)微小區(qū)域的分子結(jié)合情況予以空間上的示蹤,，從而提供遠(yuǎn)多于傳統(tǒng)SPR 的信息,。換言之，SPRM 不但以提供傳統(tǒng)SPR 獲取的信息,，還可以對(duì)諸如細(xì)胞表面與藥物分子作用的異相性進(jìn)行研究,。正是其微米級(jí)的高分辨率使得傳統(tǒng)SPR 不能直接檢測(cè)的細(xì)菌或病毒結(jié)合過程成為可能。SPRM 特別有利于檢測(cè)藥物分子與處于活細(xì)胞中天然態(tài)的膜蛋白的相互作用,。
SPRm200是世界上首臺(tái)將表面等離子體共振技術(shù)和光學(xué)顯微鏡巧妙結(jié)合為一體的生物傳感檢測(cè)儀,。它為免標(biāo)記研究分子相互作用的領(lǐng)域開辟一個(gè)嶄新的前沿。專門針對(duì)細(xì)胞膜蛋白和相關(guān)分子免標(biāo)記檢測(cè)而設(shè)計(jì)的SPRm200,，使您在不需要從細(xì)胞中提取和分離膜蛋白的前提下實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)并同時(shí)測(cè)量藥物和靶點(diǎn)在細(xì)胞上的結(jié)合過程,。還可進(jìn)行對(duì)藥物和在天然狀態(tài)下的膜蛋白之間相互作用的測(cè)量。由于出色的靈敏度和穩(wěn)定性,，SPRm200能夠測(cè)量納米尺度上的結(jié)合行為,，可用于研究細(xì)菌或病毒與抗菌性藥物的相互作用，以及發(fā)展新型藥物載遞納米顆粒,。
活細(xì)胞上免標(biāo)記生物分子結(jié)合過程的檢測(cè)
實(shí)時(shí)結(jié)合力及動(dòng)力學(xué)定量測(cè)量像圖? 光學(xué)和表面等 離子體共振同時(shí)成像
藥物分子對(duì)多細(xì)胞或單細(xì)胞作用的檢測(cè)
納米尺度上分子結(jié)合過程的跟蹤檢測(cè)
SPRm 200 系統(tǒng)主要參數(shù)一覽表
| 基礎(chǔ)配置 | 光源 | 690 nm |
| 入射角 | 40-76 Deg (連續(xù)) | |
| 基線噪聲 | < 0.6 RU RMS (0.1 mDeg RMS) | |
| 基線漂移 | 3 RU/hr (0.5 mDeg/hr) （當(dāng)周圍環(huán)境漂移< 1°C/hr) | |
| 溫度控制范圍 | 15°C to 40°C （降溫限止在低于室溫10°C) | |
| 視場 | Bright Field: 1200 x 900 um SPR: 600 x 450 um | |
| 放大倍數(shù) | Bright Field: x10 SPR: x20 | |
| 分辨率 | Bright Field & SPR: 1 μm | |
| 平臺(tái)的平移和旋轉(zhuǎn)（范圍） | 3mm x 3mm / 360 deg | |
| 外形尺寸 | 690 (w) x 330 (h) x 340 (d) mm | |
| 重量 | 23 kg | |
| 電源 | 110-230 V 50/60 Hz | |
| 流體處理 | 樣品體積 | 1 to 1500 μL (application dependent) |
| 動(dòng)力學(xué)常量 | k a <1 x 107 M-1 s-1k d >1 X 10-5 s-1 | |
| 離解常量 | KD = 10-3 M (1 mM) to 10-12 M (1 pM) | |
| 分子量篩截 | 200 Da | |
| 控制體系 | 電腦 | 微軟Windows操作系統(tǒng) |
| 軟件 | ImageSPRTM 軟件,，包括數(shù)據(jù)分析和動(dòng)力學(xué)分析包 | |
| 自動(dòng)進(jìn)樣器（可選） | 試樣容量 | 2 x SBS standards (384/96)2 x 48 Vials (1.5ml)2 x 12 Vials (10ml) |
| 注射體積 | 0ml to 9999ml | |
| 樣品冷卻 | Minimum: 4℃+/-2℃ | |
| 外圍尺寸 | 300(W) x 575 (h) x 360 (d) mm |
典型應(yīng)用：
相比傳統(tǒng)的SPR技術(shù)只能在整體傳感區(qū)域內(nèi)（通常稱之為通道）測(cè)量平均共振角度的變化， SPRm200探測(cè)器能夠測(cè)量局部像素點(diǎn)上的共振角度變化并且記錄每一個(gè)像素點(diǎn)上的傳感曲線圖,。如圖2 就顯示了SPRm200同時(shí)記錄的明視場圖和SPR像圖以及圖中任何一點(diǎn)或區(qū)域的傳感曲線圖,。因此它能提供更多的局部信息,，并且可以在自然狀態(tài)下研究膜蛋白的非均相表面結(jié)合以及它們和藥物之間的相互作用。
SPRM 圖像 – 同時(shí)的明場圖像(A) 和SPR 圖像(B).各部位的結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)可從傳感譜圖(C)中算出,。
凝集素 - 糖蛋白相互作用
基本的細(xì)胞和治療過程通常開始于配體與膜蛋白的結(jié)合,，并且膜蛋白在其天然狀態(tài)中的結(jié)合活性研究對(duì)于理解它們的生物學(xué)功能至關(guān)重要。這里是研究糖蛋白（膜蛋白）和凝集素（配體）之間的特異性相互作用以及單個(gè)細(xì)胞膜上的受體的結(jié)合活性和空間分布的實(shí)例,。
神經(jīng)瘤細(xì)胞SHEP1在芯片上的細(xì)胞室中被孵化,，然后置于SPRM樣品臺(tái)上。 將PBS緩沖液在25℃以300ul/min的流速加入細(xì)胞室,。將凝集 素,，80ug/ml的小麥胚芽凝集素（WGA），注入細(xì)胞室,，然后用PBS緩沖液沖洗。用不同的WGA濃度（5,， 10,， 40， 80,， 100,， 200ug/ml）重復(fù)對(duì)細(xì)胞的類似測(cè)量。使用50mM GlcNAc 溶液來再生細(xì)胞表面上 的膜糖蛋白受體,。用不同的WGA濃度（5,， 10， 40,， 80,，100， 200 μg/ml）重復(fù)對(duì)細(xì)胞的進(jìn)行類似測(cè)量,，則可以得到如右圖所示的一系列傳感曲線圖,。將每個(gè)像素的數(shù)據(jù)予以平均后，可以使用一級(jí)結(jié)合動(dòng)力學(xué)模型（參見下文）推導(dǎo)出細(xì)胞不同部位上的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù),。我們儀器測(cè)量結(jié)果與以前發(fā)表的數(shù)據(jù)十分吻合[4],。
nACHRs 的結(jié)合行為的定位
nAChR膜受體在神經(jīng)傳遞和尼古丁成癮中起著關(guān)鍵作用，通常測(cè)定受體在細(xì)胞中的分布使用熒光標(biāo)記的二抗,。由于熒光檢測(cè)不能提供直接的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)而容易導(dǎo)致假陽性的結(jié)論,，SPRm200因?yàn)橹苯訙y(cè)量一抗與不含二抗的nAChR的結(jié)合，該過程不僅更加簡單,，且克服了被標(biāo)記的二抗所引起的不確定因素,。
上圖中，工程化SH-EP1細(xì)胞在膜上表達(dá)α4β2 受體,，并結(jié)合初代抗體抗α4（右圖）,。通過SPR 像圖所顯示的nAChR 同其初代抗體結(jié)合的分布（粉紅色）,，可以明顯看出這是一個(gè)非均相的表面結(jié)合。用SH-EP1野生型細(xì)胞來作為對(duì)照,， 傳感曲線右下圖A顯示了兩種類型的細(xì)胞對(duì)nAChR的反應(yīng)具有顯著差異,。如傳感圖B中所示，從SH-EP1工程化細(xì)胞反應(yīng)減去野生型細(xì)胞反應(yīng)（主要出于體積折射率效應(yīng)）可以得到nAChR與其**抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué),，它們分別為kon = 6×104/Ms,，koff = 3×10-3/s 和KD=45nM。
納米顆粒檢測(cè)
SPR光源按共振角度投射到傳感器芯片上使其產(chǎn)生一個(gè)沿著金屬膜表面?zhèn)鞑サ谋砻娴入x子體(SP)波,，如圖3所示,。當(dāng)一個(gè)納米顆粒結(jié)合到芯片表面時(shí)，它便成為SP波的散射點(diǎn),，因而會(huì)在SPR像中產(chǎn)生波紋圖案,。其形狀遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于納米顆粒的實(shí)際尺寸（100 倍以上）。這放大的波紋圖案使得SPRm200能夠檢測(cè)到粒子尺度遠(yuǎn)小于其光學(xué)衍射的極限,，通過對(duì)這個(gè)放大的波紋圖案進(jìn)行跟蹤和測(cè)量,，就能實(shí)現(xiàn)對(duì)分子在納米尺度下的結(jié)合行為進(jìn)行監(jiān)測(cè)和研究。
在納米尺度上,，由一個(gè)納米顆粒所產(chǎn)生的SPR響應(yīng)信號(hào)非常獨(dú)特,。就好像把一個(gè)小石子放在一個(gè)緩緩流動(dòng)的淺溪中，水面上就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)波紋圖案（參考左圖）,。 在SPR像中,，這些波紋的產(chǎn)生以及其強(qiáng)度的變化為納米顆粒和芯片表面或和溶液中其它分子的相互作用提供了非常豐富的信息[1，5],。
細(xì)菌和抗生素
活的大腸桿菌O157:H7 在LB肉湯培養(yǎng)基中通過抗體偶聯(lián)被系在傳感器芯片上,。他們因散射芯片中的SP波而在SPR像上產(chǎn)生許多點(diǎn)波紋如下圖右邊所示。
雖然明視場的細(xì)菌細(xì)胞像（小黑點(diǎn)）穩(wěn)定,，SPR像中的點(diǎn)波紋強(qiáng)度有著顯著的變化,。通過監(jiān)測(cè)這些波紋在納米尺度下的強(qiáng)度波動(dòng)，可為我們提供細(xì)菌細(xì)胞的新陳代謝的重要信息,。當(dāng)將500μg/mL的殺菌性抗生素多粘菌素B（PMB）加入細(xì)胞室時(shí),，細(xì)菌細(xì)胞的波動(dòng)急劇減弱（下右圖），從而表征細(xì)菌的死亡,。
暫無數(shù)據(jù),！
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