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高效色譜柱篩選

尿嘧啶和黃嘌呤,，即咖啡因、可可堿和茶堿,，是一組在各種生物過程和人類消費(fèi)中起重要作用的有機(jī)化合物[1-3],。這些分子屬于雜環(huán)化合物，其特點是含有碳原子和氮原子的環(huán)狀結(jié)構(gòu),。尿嘧啶是 RNA(核糖核酸)的基本組成部分,，RNA 是形成遺傳密碼并參與蛋白質(zhì)合成的基本核堿基之一。另一方面,，黃嘌呤,、咖啡因、可可堿和茶堿是一類結(jié)構(gòu)相似但生物效應(yīng)不同的生物堿[1-3],。這些黃嘌呤存在于各種植物中,，是一種眾所周知的興奮劑，可以穿過血腦屏障,，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng),。在 RP(反相色譜)[1-3]條件下(SN_802_2023)， LC(液相色譜)可分離生物堿,。

超臨界流體色譜(SFC)是一種使用超臨界二氧化碳(CO2)作為流動相的基本成分的色譜技術(shù),。這種狀態(tài)的二氧化碳被稱為超臨界，它具有獨(dú)特的特性,，如高擴(kuò)散系數(shù)和低粘度,，使其成為分離和分析化合物的絕佳溶劑。與傳統(tǒng)色譜方法相比,，SFC 提供了許多優(yōu)勢,，包括更快的分析時間，更低的溶劑消耗和分離的差異選擇性。此外,，與 RP-LC 相比,，SFC 代表了一種正交技術(shù)，為各種分析挑戰(zhàn)提供了互補(bǔ)的分離能力,。

在 SFC 中,，色譜柱篩選包括測試不同的固定相，以找到最適合特定分離任務(wù)的固定相,。固定相是色譜系統(tǒng)的重要組成部分,，因為它直接影響色譜的選擇性。不同的固定相具有不同的化學(xué)功能和與分析物的相互作用,，使它們或多或少地選擇特定的化合物,。通過篩選和選擇合適的色譜柱，可以優(yōu)化分離條件,，以獲得更好的目標(biāo)分析物的分辨率和靈敏度,。

本文描述了使用 Sepmatix 8x SFC 儀器對尿嘧啶、咖啡因,、可可堿和茶堿混合物進(jìn)行平行柱篩選,，隨后轉(zhuǎn)移到制備的 Sepiatec SFC-50。

1 設(shè)備

• Sepiatec SFC-50 instrument

• Sepmatix 8x SFC instrument

• PrepPure Silica, 5μm, 250 x 10mm

• PrepPure Diol, 5μm, 250 x 10mm

• PrepPure Silica, 5μm, 250 x 4.6mm

• PrepPure Diol, 5μm, 250 x 4.6mm

• PrepPure Amino, 5μm, 250 x 4.6mm

• PrepPure 2-EP, 5μm, 250 x 4.6mm

• Reprosil 4-EP, 5μm, 250 x 4.6mm (Dr. Maisch GmbH)

• PrepPure PEI, 5μm, 250 x 4.6mm

• PrepPure CBD, 5μm, 250 x 4.6mm

• Cyano, 5μm, 250 x 4.6mm, (Dr. Maisch GmbH)

  
  

2 試劑和材料

• 二氧化碳(99.9%)

• 甲醇(≥99%)

• 尿嘧啶(99% + %)

• 可可素(99%)

• 咖啡(99%以上)

• 茶堿(99%)

3 實驗

樣品制備：

在 50/2.5mL 甲醇/水混合液中,，40℃ 下用超聲水浴溶解 0.05g 尿嘧啶,，0.07g 咖啡因，0.055g 可可堿,，0.085g 茶堿,。

Sepmatix 8x SFC 篩選運(yùn)行條件：

流動相：A =二氧化碳：甲醇

流速：3ml /min(每柱)

流動相條件：

0-0.5min：5% B

0.5-8.0min：5 - 50%

8.0-9.4min：50%

9.4-9.5min：50 - 5%

9.5-10min：5% B

檢測：紫外掃描波段：200nm - 600nm

篩選運(yùn)行是自動開始的。使用流量控制單元將流量設(shè)置為每通道 3mL/min,，并平衡色譜柱,。自動進(jìn)樣(V=5 μL)，開始平行篩選(運(yùn)行時間=10min),。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150bar,，柱箱加熱至 32°C。

SFC-50 運(yùn)行條件：

流動相：A =二氧化碳,；B=甲醇

流動相條件：等度運(yùn)行條件

檢測：紫外波長 270nm

SFC 柱在規(guī)定的流速下條件預(yù)熱 3 分鐘，使用定量環(huán)自動注入樣品并開始運(yùn)行,。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150bar,，柱箱加熱至 40°C。

3 結(jié)果與討論

用 Sepmatix 8x SFC 篩選色譜柱：

為了確定樣品的最佳分離選擇性,，進(jìn)行了不同色譜柱的篩選,。使用 Sepmatix 8x SFC 儀器可以高效地同時篩選8個色譜柱。因此，最佳選擇性可以在很短的時間內(nèi)確定,。為此,，使用了 8 種不同的固定相:硅膠、二醇基,、氨基,、氰基、2-EP,、4-EP,、PEI 和 CBD，圖1顯示了篩選的結(jié)果,。

▲圖1：Sepmatix 8x SFC 儀器篩選結(jié)果,。從左到右依次為:硅膠、氨基,、氰基,、二醇基；下從左至右依次為：2-EP,、4-EP,、PEI、CBD 柱,；運(yùn)行時間=10分鐘

用分辨率(R)來衡量色譜方法在色譜圖中分離和區(qū)分兩個相鄰峰的能力,，它量化了分析物相互分離的程度。表 1 顯示了 4 組分分離的分辨率值,。使用 Sepmatix 軟件和以下公式自動確定：

• 其中tR1 和 tR2 代表 組分 1 或組分 2 的保留時間

• W1 和W2 代表分量1或分量 2 峰高一半處的寬度

在處理復(fù)雜的混合物時,，分辨率尤其重要，因為它確保每個分析物都被很好地分離,，并且可以準(zhǔn)確地識別和定量,。分辨率為 1 表示峰值根本沒有被分解，基本上是合并的,，而更高的分辨率值表示峰值之間的分離更好,。在使用過程中，分辨率至少應(yīng)達(dá)到 1.5,，才能以適當(dāng)?shù)亩亢丸b定分析物,。

表1：SFC 不同篩選條件下的分辨率值

R 值的篩選和評價表明，硅膠,、二醇基和 PEI 相對樣品的分離選擇性最好,。二醇基在運(yùn)行時間和分辨率方面表現(xiàn)出最佳性能。硅膠柱上的分離并不完全是茶堿和咖啡因的基線分離,。PEI 相的運(yùn)行時間相對較長,，因為樣品分子的位阻較大,。表 2 為洗脫順序，這是通過測定的光譜和組分的單獨(dú)進(jìn)樣來確定的,。與其他相相比,，硅膠顯示出不同的洗脫順序。對于氰基,、2-EP 和 4-EP,，不能完全確定洗脫順序。

表2：SFC 不同色譜柱篩選條件下的洗脫順序

將開發(fā)方法通過 SFC-50 放大：

由于二醇基取得了最好的結(jié)果,，因此選擇了 5μm, 250 x 10mm 的 PrepPure 二醇基進(jìn)行 Sepiatec SFC-50 方法放大制備,。由于通過堆疊注射法純化混合物的效率明顯高于多次梯度注射法，該方法是在等度運(yùn)行條件下實施的,，這是使用堆疊進(jìn)樣的要求,。在等度條件下，樣品只能在低甲醇含量下分離(見圖2,，下),。在高甲醇濃度下，由于流動相的高洗脫強(qiáng)度,，尿嘧啶,、咖啡因、茶堿和茶堿是不可分離的(見圖2,，上),。

▲圖2：使用 PrepPure Diol 5 μm, 250 x 10mm 色譜柱分離樣品。上:流速= 20 mL/min, 150 bar, 40℃,，270nm, 33% B,，進(jìn)樣量= 0.09 mL，運(yùn)行時間= 4 min,；下:流量= 20 mL/min 150 bar 40°C, 270 nm, 12%甲醇,，0.09 mL，運(yùn)行時間= 5 min

改變壓力和溫度可以優(yōu)化分辨率,。最佳分離條件為 40℃ 和 150bar,。

圖 3 為圖 2(下)實驗條件下的堆疊進(jìn)樣情況，堆疊時間為 2.42min,，因此每 2.42min 進(jìn)樣一次,。在這種情況下，由于每次額外注入節(jié)省了平衡時間,，因此提高了產(chǎn)能,。

為了更有效的多次分離，可以使用硅膠填料,。使用 34% 的甲醇作為改性劑,，將堆疊時間縮短至 2.15min。與二醇基相比,，硅膠填料在 100bar 下表現(xiàn)出更好的性能,。然而，在 1.5 的分辨率下,，咖啡因和茶堿并不能獲得理想的基線分離,。由于硅膠的極性比二元醇高，為了快速洗脫,，必須增加改性劑的含量,，但這也導(dǎo)致溶劑消耗增加。

4 結(jié)論

在本文中,，使用 Sepmatix 8x SFC 進(jìn)行柱篩選,，并將開發(fā)結(jié)果轉(zhuǎn)移到 Sepiatec SFC-50 進(jìn)行放大。在色譜參數(shù)分辨率和運(yùn)行時間方面,，二醇基表現(xiàn)出最好的效果,。對于二醇基，根據(jù)篩選結(jié)果,，在 Sepiatec SFC-50 儀器上采用 250 × 10 mm 柱進(jìn)行等度堆疊進(jìn)樣,。作為比較，開發(fā)了另一種用于硅膠填料的方法,，但分辨率值略差,。

這種分離表明，要想在 prep-SFC 中獲得一個好的分離方法,，事先通過柱篩選確定最佳選擇性是很重要的,。然后，該方法可以在 prep-SFC 上簡單實現(xiàn),，并進(jìn)行了優(yōu)化,。最理想的是，該方法在等度條件下應(yīng)用,，以最大限度地提高產(chǎn)量,。

每次注射后的疊加紫外信號表明該方法具有良好的再現(xiàn)性(圖3和4，下面),。垂直線描述了收集相應(yīng)分?jǐn)?shù)的時間窗口,。

▲圖3：堆疊進(jìn)樣與二醇柱分離。流速= 20 mL/min, 150 bar, 40℃,，270 nm, 12% B,，進(jìn)樣量= 0.12 mL；堆疊時間:2.42 min,，注射次數(shù)：8次,；上圖：最終色譜圖,；下圖為各注射劑的紫外信號疊加圖

▲圖4：堆疊進(jìn)樣與硅膠柱分離。流速= 16 mL/min, 100 bar, 40℃,，270 nm, 34% B,，進(jìn)樣量= 0.09 mL；堆疊時間:2.15 min,，注射次數(shù)：7次,；上圖：最終色譜圖；下圖：分別在254 nm和270 nm處注射的疊加紫外信號

5 參考文獻(xiàn)

DOI: 10.1021/jf030817m

DOI: 10.1016/j.foodchem.2004.11.013

DOI: 10.1016/j.saa.2004.03.030

Laboratory Chromatography Gμide, ISBN 3-033-00339-7, by Büchi Labortechnik AG (Switzerland)