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Scale-X™hydro實驗型固定床生物反應(yīng)器
Scale-X™hydro實驗型固定床生物反應(yīng)器

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比利時Univercells尤尼賽斯Scale-X™hydro 研發(fā)型固定床生物反應(yīng)器

實驗室研發(fā)階段細胞培養(yǎng)**解決方案,!

scale-X 生物反應(yīng)器是一種新型固定床系統(tǒng),可用于貼壁和懸浮細胞系的培養(yǎng),。設(shè)備單元占地小,,而具有相當大的表面積,從而可獲得極高細胞密度,。本研究比較了在scale-X hydro生物反應(yīng)器和標準微載體培養(yǎng)體系中進行的貼壁Vero細胞培養(yǎng),。兩種系統(tǒng)可獲得相似的單位面積細胞濃度。隨后,展開螺旋卷式固定床顯示,,細胞在軸向和徑向上具有均勻的分布,。這表明在生物反應(yīng)器內(nèi)部具有均勻的液體流動和細胞附著。觀察到的均質(zhì)的細胞生長是一個重要的規(guī)模放大因素,,以按可重復(fù)的方式,,實現(xiàn)可用表面積**限度的利用。

scale-X生物反應(yīng)器簡介

大多數(shù)病毒疫苗的生產(chǎn)工藝基于貼壁細胞平臺,。典型的培養(yǎng)系統(tǒng),,如滾瓶、多層細胞培養(yǎng)皿和微載體生物反應(yīng)器,,在規(guī)模放大時,,都有一定的限制。為了克服潛在的規(guī)模放大限制,,簡化生產(chǎn),,固定床生物反應(yīng)器是一個**價值的替代選擇。創(chuàng)新的scale-X生物反應(yīng)器是一種可規(guī)模放大的固定床系統(tǒng),,可從研發(fā)(2.4 m2生長表面積)放大到中試(10和30m2生長表面積)和生產(chǎn)規(guī)模(200和600m2生長表面積,;圖1)。scale-X**技術(shù)使用了一種結(jié)構(gòu)化的螺旋卷式非編織聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)固定床,,以減少局部過度壓實和死區(qū),,同時實現(xiàn)可用內(nèi)表面積及質(zhì)量的**利用,獲得批次間的高可重復(fù)性(圖2),。

材料,、方法 & 設(shè)備

固定床工藝:scale-X hydro生物反應(yīng)器

細胞系和工藝條件

用于細胞密度和分布評估的方法

? 可從固定床提取12根整合的取樣條(每根1面積2.15 cm2)在1 mL細胞裂解緩沖液中充分混合3 min。消化的細胞核用結(jié)晶紫染色并進行計算,。

? 當達到目標細胞密度后,,取出固定床,,小心地鋪開,,剪下確定的1 cm2面積(圖3)。條帶上的細胞用試劑A100(ChemoMetec)裂解,,并使用血細胞計數(shù)器對細胞核進行計數(shù),。

圖1. scale-X生物反應(yīng)器規(guī)格,從hydro(2.4 m2,,用于R&D)到carbo(10和30 m2,,用于臨床期)以及nitro(200和600 m2,用于大型生產(chǎn))

圖2. scale-X生物反應(yīng)器系列中的**固定床結(jié)構(gòu)及培養(yǎng)基流道

圖3. scale-x固定床中用于細胞密度檢測的取樣點

早期研發(fā)階段的工藝選擇對疫苗的開發(fā)至關(guān)重要,,一次性生物反應(yīng)器的投入應(yīng)從小規(guī)模細胞培養(yǎng)開始,,Scale-X™hydro 是一款結(jié)構(gòu)緊湊、功能齊全、自動化控制的小規(guī)模固定床生物反應(yīng)器,,有效降低了疫苗開發(fā)成本,,一次性載體、管路,,方便了工藝開發(fā)操作,,保證了細胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性!

對照工藝:在攪拌罐生物反應(yīng)器(STR)中進行Cytodex® 1微載體培養(yǎng)

細胞系和工藝條件

用于細胞密度和分布評估的方法

? 從生物反應(yīng)器取5 mL樣品體積,。進行三次的洗脫后,,用0.1 M檸檬酸、0.1%結(jié)晶紫和0.1% Triton X-100溶液裂解細胞,。

? 37℃孵育1小時后,,用血細胞計數(shù)器對染色的細胞核進行計數(shù)。該方法詳細描述,,參見Trabelsi et al.文章(Khaled Trabelsi,, 2004)。

工藝參數(shù)(用于兩種培養(yǎng))

? 添加4 mM谷氨酰胺的無血清培養(yǎng)基(VP-SFM,, Gibco™)

? 補加葡萄糖和谷氨酰胺原液,,以分別防止兩種底物低于8 mM和2 mM

? 使用CO2和 0.5 NaHCO3(微載體)或0.5 NaOH(scale-X)將pH值控制為7.2

? 溫度設(shè)定點為37℃

? 溶氧設(shè)定點為50%(頂部空間通氣)

VERO細胞生長

比較不同生物反應(yīng)器系統(tǒng)內(nèi)的**Vero細胞密度(Kiesslich,2020)(圖4):

scale-X hydro 生物反應(yīng)器(2.4 m2):2.7 x 105 cells/cm2

STR Cytodex® 1(0.75 m2):2.4 x 105 cells/cm2

不同的細胞接種密度導(dǎo)致了不同但相當?shù)纳L曲線圖,。scale-X生物反應(yīng)器中的單位面積細胞密度(2.7x 105 cells/m2)略高于微載體培養(yǎng)(2.4 x 105 cells/m2),。兩種系統(tǒng)的培養(yǎng)基使用量接近,為2.1 - 2.2 ×109 cells/L培養(yǎng)基,。當考慮兩個系統(tǒng)在同等產(chǎn)量下的反應(yīng)器體積時,,固定床生物反應(yīng)器的設(shè)備占地顯著降低(降低5倍)。

圖4. 相比標準微載體培養(yǎng),,scale-X hydro生物反應(yīng)器中的Vero細胞生長,,由Kiesslich et al.(2020)提供。

Univercells進行了延長的Vero細胞生長研究(圖5),。在scale-X hydro生物反應(yīng)器中進行了多次實驗(n=26),,獲得了可重復(fù)的細胞密度,平均為2.5×105 cells/cm2,。規(guī)模放大至更大的scale-X carbo生物反應(yīng)器(10m2和30m2),,可獲得相似的單位面積細胞密度。

圖5. Vero 細胞曲線圖:試驗以Vero 細胞生長在不同scale-x 規(guī)格體積(內(nèi)部數(shù)據(jù))

在結(jié)構(gòu)化,、螺旋卷式固定床中的Vero細胞分布

在培養(yǎng)的不同階段(2.7×105 cells/cm2和5.3×105 cells/cm2時,,圖6),對Vero細胞分布進行了研究,。為此,,從展開的固定床中提取了9個樣本,,并測定細胞密度。

在scale-X hydro生物反應(yīng)器中,,Vero細胞在固定床中軸向和徑向均勻分布,。研究進行了進一步的計算機流體動力學研究,結(jié)果顯示,,在結(jié)構(gòu)化固定床中沒有死區(qū)和非均勻性(數(shù)據(jù)未顯示),。均勻的細胞生長使可用表面積得到充分利用。

圖6. scale-X生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)化固定床中的Vero細胞生長分布,。

細胞沿徑向(從中心半徑)和軸向(固定床高度)均勻分布,。(a.)由Kiesslich et al.(2020)友情提供,(b.)在Univercells實驗室進行,。

總結(jié)

在這兩種工藝中,,貼壁Vero細胞達到了相同的密度。當轉(zhuǎn)移到更大的固定床scale-X生物反應(yīng)器時,,達到了類似的細胞生長趨勢和**單位面積細胞密度,。*后,對Vero細胞生長分布的研究顯示,,固定床內(nèi)有均勻的細胞貼壁和生長,。與微載體工藝相比,固定床的緊湊設(shè)計使設(shè)備占地面積降低5倍,。

總體而言,,結(jié)果表明,結(jié)構(gòu)化的scale-X固定床生物反應(yīng)器系統(tǒng)是傳統(tǒng)“規(guī)模擴展”技術(shù)的合適替代方案,,后者如多層培養(yǎng)皿和滾甁,,也包括具有一定技術(shù)挑戰(zhàn)性的培養(yǎng)系統(tǒng),如微載體工藝,。

目前的scale- X生物反應(yīng)器可以轉(zhuǎn)化至生產(chǎn)規(guī)模(600 m2),,并整合到連續(xù)的NevoLine™生產(chǎn)平臺中。NevoLine系統(tǒng)將強化的上游工藝與連續(xù)的下游工藝相結(jié)合,,以降低資本投入和運營成本,,實現(xiàn)低成本、大規(guī)模的生產(chǎn)能力,。

參考文獻

Khaled Trabelsi,, S. R. (2004). Comparison ofvarious culture modes for the production of rabies virus by Vero cells grown onmicrocarriers in a 2-l bioreactor. Enzyme and Microbial Technology.

Kiesslich, S.V.-C.-F. (2020). Serum-free production of rVSV-ZEBOV in Vero cells:Microcarrier bioreactor versus scale-X™ hydro fixed-bed. Journal of Biotechnology.

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