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xCELLigence?實(shí)時(shí)細(xì)胞分析（RTCA）DP儀器使用無(wú)創(chuàng)電阻抗監(jiān)測(cè),，以無(wú)標(biāo)簽的實(shí)時(shí)方式量化細(xì)胞增殖,，形態(tài)變化和附著質(zhì)量。 DP模型與其他xCELLigence儀器的區(qū)別是其使用電子集成的Boyden室（CIM-Plate?16）進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移（CIM）進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量的能力,。 DP儀器的三個(gè)支架允許三個(gè)獨(dú)立的電子16孔板并聯(lián)或彼此獨(dú)立地進(jìn)行控制和監(jiān)控,，從而實(shí)現(xiàn)多個(gè)用戶(hù)的**生產(chǎn)力。將儀器置于標(biāo)準(zhǔn)的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中,，并通過(guò)連接到孵化器外部的控制單元（筆記本電腦）的電纜進(jìn)行供電和控制,。用戶(hù)友好的RTCA軟件允許與所有三個(gè)支架實(shí)時(shí)接口，并包括實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)顯示和分析功能,。

細(xì)胞阻抗說(shuō)明

在細(xì)胞生物化學(xué)測(cè)定和全身生物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之間定位,，基于細(xì)胞的測(cè)定是基礎(chǔ)和應(yīng)用生物學(xué)研究不可缺少的工具,。然而，許多基于細(xì)胞的測(cè)定法的用途通過(guò)以下方式減少了：（1）需要使用標(biāo)記,；（2）與連續(xù)監(jiān)測(cè)不相容（即僅產(chǎn)生終點(diǎn)數(shù)據(jù)）,；（3）與正交試驗(yàn)不相容；和（ 4）無(wú)法提供客觀(guān)/定量的讀數(shù),。然而，這些缺點(diǎn)都是通過(guò)非侵入性的,，無(wú)標(biāo)記的和實(shí)時(shí)的細(xì)胞阻抗測(cè)定來(lái)克服的,。 細(xì)胞阻抗測(cè)定的功能單元是融合到微量滴定板孔的底部表面的一組金微電極（圖1）。當(dāng)浸沒(méi)在導(dǎo)電溶液（如緩沖液或標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)基）中時(shí),，在這些電極上施加電位會(huì)使電子離開(kāi)負(fù)極,，通過(guò)本體溶液，然后沉積到正極端以完成電路,。因?yàn)檫@種現(xiàn)象取決于電極與本體溶液相互作用,，所以在電極 - 溶液界面處的粘附細(xì)胞的存在阻礙了電子流動(dòng)。該阻抗的大小取決于細(xì)胞的數(shù)量,，細(xì)胞的大小和形狀以及細(xì)胞 - 基底附著質(zhì)量,。重要的是，金微電極表面和施加的電位（22 mV）都不影響細(xì)胞的健康或行為,。

圖1.細(xì)胞阻抗裝置概述在單元格添加之前和之后顯示單個(gè)孔的側(cè)視圖,。電極和電池都不被拉伸（為了清晰起見(jiàn)，它們被放大）,。在不存在電池的情況下,，電流自由流動(dòng)通過(guò)培養(yǎng)基，完成電極之間的電路,。由于細(xì)胞在電極上粘附并增殖，電流流動(dòng)受阻,，提供了細(xì)胞數(shù)量,，細(xì)胞大小/形態(tài)以及細(xì)胞 - 基質(zhì)附著質(zhì)量的非常靈敏的讀數(shù)。

阻抗電極

ACEA E-Plate板中每孔中的金微電極生物傳感器覆蓋70-80％的表面積（取決于是否存在視野區(qū)域）,。而不是圖1所示的簡(jiǎn)化的電極對(duì),，E-Plate板的每個(gè)孔中的電極被連接成形成交錯(cuò)陣列的“線(xiàn)”（圖2）。這種布置可以同時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞群體,，從而提供精確的靈敏度：附著于板的細(xì)胞數(shù),，細(xì)胞的大小/形態(tài)以及細(xì)胞 - 基質(zhì)附著質(zhì)量。

圖2. ACEA E-Plate板上的阻抗電極,。 （A）E-Plate板的每個(gè)孔中使用的叉指電極的簡(jiǎn)化示意圖,。電極沒(méi)有按比例繪制（僅顯示一些電極，為了清晰起見(jiàn)，它們已被放大）,。雖然細(xì)胞也可以在金電極表面上可視化,，但在中間的無(wú)電極區(qū)域有助于顯微成像（亮場(chǎng)，熒光等）,。 （B）16孔E-Plate板中單孔的照片,。 （C）放大陰影電極和未染色人體細(xì)胞的明場(chǎng)圖像。 （D）復(fù)合顯微鏡中觀(guān)察到的金電極和結(jié)晶紫染色的人細(xì)胞,。

用于實(shí)時(shí)細(xì)胞遷移/浸潤(rùn)的設(shè)備

盡管它可以與其他xCELLigence儀器一樣運(yùn)行測(cè)試,，但是xCELLigence RTCA DP模型具有使用ACEA CIM-Plate進(jìn)行實(shí)時(shí)細(xì)胞侵襲/遷移測(cè)定的附加功能，該實(shí)驗(yàn)基本上是電子集成的Boyden室,。如圖3A所示,，將細(xì)胞直接置于微孔膜的頂部（遷移測(cè)定）上或在預(yù)先沉積在膜上的基底膜基質(zhì)和/或細(xì)胞單層的頂部（入侵測(cè)定）上放置在上室中。移動(dòng)到下腔室的化學(xué)引誘劑,，細(xì)胞通過(guò)微孔膜,，然后沉積到金阻抗電極上（在本技術(shù)概述的前兩節(jié)中描述）。這提供了細(xì)胞遷移/侵襲的非常靈敏和可重復(fù)的連續(xù)動(dòng)力學(xué)記錄（圖3B）,。使用顯微成像定量遷移細(xì)胞的平行測(cè)定證明了CIM-Plate的阻抗信號(hào)與已經(jīng)遷移的細(xì)胞數(shù)量之間的**相關(guān)性,。

圖3.細(xì)胞侵襲/遷移的定量實(shí)時(shí)分析。 （A）CIM板細(xì)節(jié),。上圖顯示了CIM-Plate八孔的剖視圖,。下圖中的放大圖示出了單個(gè)孔的上部和下部室。上室的底表面由細(xì)胞可以遷移穿過(guò)的微孔膜組成,。該膜下側(cè)的金電極檢測(cè)粘附細(xì)胞的存在,。對(duì)于簡(jiǎn)單的遷移測(cè)定（本文未示出），被監(jiān)測(cè)的細(xì)胞將直接電鍍?cè)谀ど?。?duì)于入侵測(cè)定（在此顯示）,，將細(xì)胞鋪在基底膜基質(zhì)，細(xì)胞單層或其某些組合的頂部,。 （B）在存在或不存在化學(xué)引誘物的情況下實(shí)時(shí)分析鼠巨噬細(xì)胞遷移。在沒(méi)有細(xì)胞（陰性對(duì)照;藍(lán)線(xiàn)）的情況下,，阻抗信號(hào)在測(cè)定的75分鐘內(nèi)不變,。雖然一些細(xì)胞在不存在化學(xué)引誘物（綠線(xiàn)）的情況下遷移通過(guò)多孔膜，但當(dāng)化學(xué)引誘物存在于CIM板的下室（紅線(xiàn)）時(shí),，巨噬細(xì)胞遷移顯著刺激,。圖“B”改編自PLoS One。 2013年3月8（3）：e58744,。

實(shí)時(shí)阻力跟蹤說(shuō)明

使用稱(chēng)為細(xì)胞指數(shù)（CI）的無(wú)單位參數(shù)報(bào)告了由貼壁細(xì)胞引起的電子流的阻抗,，其中CI=(時(shí)間點(diǎn)n阻抗-不存在細(xì)胞時(shí)阻抗）/標(biāo)稱(chēng)阻抗值,。圖3提供了在建立和運(yùn)行凋亡實(shí)驗(yàn)過(guò)程中實(shí)時(shí)阻抗曲線(xiàn)的通用示例。在細(xì)胞添加到孔中的頭幾個(gè)小時(shí)之后,，阻抗快速增加,。這是由于懸浮液中的細(xì)胞脫落,，沉積在電極上并形成局部粘連,。如果添加的細(xì)胞的初始數(shù)量低,，并且在井底上存在空的空間，則細(xì)胞將增殖,，導(dǎo)致CI逐漸但穩(wěn)定增加。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到匯合CI值時(shí),，反映了大容量介質(zhì)可接近的電極表面積不再改變的事實(shí)。此時(shí)加入細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑導(dǎo)致CI降低至零,。這是細(xì)胞四舍五入,，然后從井底分離的結(jié)果。雖然這個(gè)通用實(shí)例涉及細(xì)胞融合時(shí)的藥物添加,，基于阻抗的測(cè)定是非常靈活的,，并且還可以評(píng)估初始細(xì)胞粘附到電極的速率和程度，或細(xì)胞增殖的速率和程度,。

圖4.用于建立和運(yùn)行凋亡測(cè)定的通用實(shí)時(shí)阻抗曲線(xiàn)。 在文中解釋了阻抗曲線(xiàn)的每個(gè)階段及其產(chǎn)生的蜂窩行為,。

超出上述通用示例,，圖5顯示了使用ACEA的xCELLigence 實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記儀器中的E-Plate采集的實(shí)際實(shí)時(shí)阻抗數(shù)據(jù)。 圖5A顯示了將A549細(xì)胞加入到E-Plate板中的前兩小時(shí)的阻抗曲線(xiàn),，其中孔預(yù)先用不同濃度的膠原IV包被,。 雖然圖5B顯示了在將HeLa細(xì)胞暴露于GPCR激動(dòng)劑多巴胺的前幾分鐘內(nèi)發(fā)生的細(xì)胞指數(shù)的變化，圖5C評(píng)估在20小時(shí)內(nèi)NK細(xì)胞介導(dǎo)的癌細(xì)胞的細(xì)胞溶解,。 圖5D突出顯示根據(jù)藥物作用機(jī)制可能在細(xì)胞指數(shù)中發(fā)生的變化。

圖5.使用E-Plate板和xCELLigence RTCA儀器獲得的實(shí)時(shí)阻抗曲線(xiàn)示例,。 （A）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)已經(jīng)預(yù)先涂覆不同濃度膠原IV的E-Plate孔的A549細(xì)胞粘附。請(qǐng)注意阻抗值（細(xì)胞指數(shù)）與顯微鏡中可見(jiàn)的貼壁細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性,。 （B）暴露于不同濃度GPCR激動(dòng)劑多巴胺的HeLa細(xì)胞的實(shí)時(shí)阻抗曲線(xiàn),。黑色箭頭表示多巴胺加入的時(shí)間,。 （C）用于NK細(xì)胞介導(dǎo)的MCF7乳腺癌細(xì)胞溶解的實(shí)時(shí)阻抗曲線(xiàn)。 （D）暴露于藥物的A549細(xì)胞的實(shí)時(shí)阻抗曲線(xiàn)顯示各種作用機(jī)制,。

與細(xì)胞相關(guān)的阻抗

RTCA提供細(xì)胞數(shù)量,，增殖率，細(xì)胞大小/形狀和細(xì)胞 - 底物附著質(zhì)量的定量讀數(shù),。由于這些物理性質(zhì)是數(shù)千種不同基因/蛋白質(zhì)的產(chǎn)物,，因此RTCA可以為細(xì)胞健康和行為提供非常廣泛的視野。在xCELLigence儀器上已經(jīng)成功地分析了從內(nèi)皮屏障功能和趨化性到絲狀偽足動(dòng)力學(xué)和免疫細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解的一切,。盡管它們的廣泛性,，xCELLigence測(cè)定仍然能夠詢(xún)問(wèn)非常具體的生化和細(xì)胞現(xiàn)象。適當(dāng)使用對(duì)照和/或正交技術(shù)使得可以將阻抗跡線(xiàn)的特征與特定的細(xì)胞/分子現(xiàn)象相關(guān)聯(lián),。