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噴霧干燥-制備色譜聯(lián)用技術(shù) ：從植物中分離純化二芳基庚烷類化合物——紅榿木素

步琦 2022-01-20 | 閱讀：1126

從天然產(chǎn)物中尋找活性成分,，全世界很多科研工作者一直在開展這項(xiàng)工作,，特別是新冠疫情以來(lái)，科學(xué)家們也期待從天然產(chǎn)物中篩選出療效確切的抗病毒成分,。本應(yīng)用案例采用一個(gè)全新的方法組合：通過(guò)水提取,，結(jié)合噴霧干燥&制備色譜聯(lián)用技術(shù)來(lái)探索簡(jiǎn)單、快速,、經(jīng)濟(jì)地獲取高純度天然活性成分紅榿木素（純度>95%）以及商業(yè)化的可行性,，整個(gè)過(guò)程也極大減少了有機(jī)溶劑的使用，該方案也可以用于其它天然產(chǎn)物加工工藝中,。我們?cè)诖朔窒?，希望能給廣大科研同仁提供一些思路參考。

紅榿木是廣泛分布在北美太平洋西北部的硬木樹種,，呈金黃色,，也叫黃金榿木，喜溫暖氣候,，出材率高,，材質(zhì)堅(jiān)硬有彈性和韌性。一般取芯材做木材后,，丟棄了很大部分的樹皮,、樹枝、葉子和較小莖等,，這些殘留物被留在森林中,、用作燃料,、堆肥等。但其實(shí)里面含有藥用價(jià)值很高的天然產(chǎn)物化學(xué)物質(zhì),，具有治療發(fā)燒,、出血、燒傷,、抗氧化,、抗菌和抗癌的特性。發(fā)揮該藥用價(jià)值的主要活性成分是二芳基庚烷類化合物,，其中的紅榿木素{Oregonin,，(5S)-1,7-bis(3,4-dihydroxyphenyl)-5-(β-D-xylopyranosyloxy)-heptan-3-one}含量最高，在葉子和樹皮中濃度高達(dá)4-9%,。因此尋找工業(yè)化的提取,、干燥和純化工藝處理大規(guī)模的林業(yè)加工殘留物，從而實(shí)現(xiàn)紅榿木更多的商業(yè)化價(jià)值,。

紅榿木素和其它二芳基庚烷類化合物傳統(tǒng)的提取方法是采用氯仿,、二氯甲烷、甲醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行索氏提取,，該方法會(huì)溶解一部分植物中脂和蠟,，后續(xù)需要進(jìn)行脫脂處理，操作比較麻煩,；同時(shí)有機(jī)溶劑的提取也不容易擴(kuò)展到工業(yè)化生產(chǎn),。故直接采用水提法得到目標(biāo)化合物，既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保更安全,；同時(shí)紅榿木素在103 ℃時(shí)易于降解,，水萃取液如何除水就是一項(xiàng)挑戰(zhàn)了。對(duì)于熱敏性水提物的干燥方式常用冷凍干燥進(jìn)行,。但凍干需要的設(shè)備投入更大,、耗時(shí)長(zhǎng)、生產(chǎn)成本極高,。故采用經(jīng)典的噴霧干燥法開辟一條新的可實(shí)現(xiàn)的工業(yè)化工藝,。

01 儀器

02 水提取

將紅榿木葉、嫩枝和樹皮（50克）用水浸泡（150毫升）,，考察不同提取溫度（20/35/50/65 ℃）,，高速攪拌機(jī)攪拌10分鐘。所得漿液在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度（22 ℃）下繼續(xù)攪拌 30 分鐘,，隨后過(guò)濾以去除不溶性植物殘留物。過(guò)濾后的提取物在室溫下以 1400 rpm 的轉(zhuǎn)速離心 12 分鐘,。所得上清液為半透明,、橙褐色液體,，待后續(xù)使用高效液相色譜法測(cè)試活性成分和噴霧干燥使用。

03 水提物的噴霧干燥

將不同溫度下獲得的提取液經(jīng)噴霧干燥得到粗紅榿木素提取物粉末,。噴霧干燥工藝使用瑞士步琦公司小型噴霧干燥儀B-290進(jìn)行,，二流體噴嘴（噴嘴0.7mm和1.5mm噴嘴帽），搭配高效旋風(fēng)分離器,。實(shí)驗(yàn)中以最大程度減少粉末損失,，低出風(fēng)溫度，收集瓶中物料含量來(lái)進(jìn)行參數(shù)考察,。噴霧干燥物料溶液固含物濃度約為1g/100ml,。

優(yōu)化的工藝參數(shù)為：

進(jìn)風(fēng)溫度190℃，

出風(fēng)溫度90℃,，

干燥氣流量Aspirator 80%,，

進(jìn)料速度20mL/min。

紅榿木素的產(chǎn)率計(jì)算：

噴霧干燥所得粉末重量占進(jìn)料水提液中總?cè)芙夤腆w重量的百分比,。

紅榿木素的降解率計(jì)算：

噴霧干燥粉末中活性物含量與進(jìn)料中溶解固體的紅榿木素含量的比率,。

考慮到噴霧干燥是一種熱處理方式，工藝工程中可能導(dǎo)致物質(zhì)降解,，有必要了解工藝過(guò)程中對(duì)活性物質(zhì)的影響,。

04 誰(shuí)提物噴霧干燥粉的分離純化

將噴霧干燥提取物干粉重新用蒸餾水溶解，配制成濃度為10%（w/w）的溶液,，使用制備液相色譜（Flash）系統(tǒng)進(jìn)行純化來(lái)獲得目標(biāo)活性成分,，采用液體上樣模式，批次進(jìn)樣15mL,。

純化條件：

洗脫溶劑：A:乙腈 B:水

初始平衡條件：水/乙腈(85:15% v/v)

色譜柱：商品化C18 Flash柱,，(填料重量120g, 填料顆粒粒徑 20–25 μm)

流速：40 ml/mim

檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm

梯度洗脫：合計(jì) 30 min

純化過(guò)程中收集的洗脫液餾分通過(guò)高效液相色譜（HPLC）方法分析，根據(jù)色譜峰面積法初步評(píng)估目標(biāo)成分含量,，餾分中紅榿木素含量大于85%的進(jìn)行合并,，并通過(guò)噴霧干燥進(jìn)行干燥，用于獲得干燥產(chǎn)物,。為了進(jìn)一步評(píng)估峰面積法判斷準(zhǔn)確性,，每次進(jìn)樣后測(cè)定的含最高濃度紅榿木素餾分進(jìn)行合并，再干燥,，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品,，通過(guò)HPLC方法進(jìn)行含量測(cè)定。在我們的研究中,，要獲得純度大于90%的紅榿木素,，可以輕松實(shí)現(xiàn)，回收率高達(dá)90%,；當(dāng)純度要求大于95%時(shí),，回收率將降低至45%以下,。

05 HPLC分析

采用 HPLC 方法進(jìn)行水提物和水提物噴霧干燥粉，以及Flash制備色譜純化后收集的餾分的檢測(cè)分析,。色譜柱 C18 column (4.6 mm × 150 mm, particle size: 2.6 μm, pore size: 100 ?),，進(jìn)樣量1μL, 流速1.0 mL/min。

下表為HPLC分析梯度洗脫條件：

06 結(jié)果分析與討論

提取工藝,，噴霧干燥產(chǎn)率和活性物質(zhì)降解率：

上面表格中詳細(xì)記錄了不同提取溫度下提取液的噴霧干燥產(chǎn)率,，熱降解率等。

從上表可以觀察到,，在 20-50℃ 的提取溫度下,，通過(guò)噴霧干燥除去溶劑后得到的紅榿木素降解率不到 10%。但在65℃時(shí),，降解率翻了一番以上,，達(dá)到 21%。提取溫度為35℃時(shí),，噴霧干燥產(chǎn)率最高,，為 75%。上述這一參數(shù)最終被采用,，并進(jìn)行后續(xù)的純化工藝,。水提物中的紅榿木素濃度與提取溫度呈顯著的正相關(guān)（R=0.95，P=0.046）,；然而,，上述因素和工藝產(chǎn)率（R= -0.095，P=0.9）以及實(shí)際噴霧干燥粉末中的紅榿木素濃度（R=0.4,，P=0.6）,，無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。雖然噴霧干燥的進(jìn)風(fēng)溫度高達(dá)190℃,，但是因?yàn)樗值恼舭l(fā)是一個(gè)快速的吸熱過(guò)程,，隨著蒸發(fā)的進(jìn)行系統(tǒng)溫度不斷降低，物料在干燥過(guò)程中沒(méi)有接觸太高的溫度,。而且噴霧干燥過(guò)程中,，物料在干燥筒中停留時(shí)間短，所以可實(shí)現(xiàn)較低的紅榿木素降解率,。當(dāng)然設(shè)置更低的加熱溫度,，也可以進(jìn)一步降低熱降解率，但進(jìn)料速度也會(huì)隨之降低,。雖然本次實(shí)驗(yàn)物料濃度低,，固含物少，但噴霧干燥實(shí)驗(yàn)過(guò)程平均產(chǎn)率仍能達(dá)到 70%，也達(dá)到實(shí)驗(yàn)室噴霧干燥儀常見(jiàn)的回收率要求,。另外,，噴霧干燥提取物粉末顆粒是一種水溶性的棕色無(wú)定型態(tài)固體，有輕微的粘性和吸濕性,。未來(lái)可以通過(guò)改進(jìn)工藝，例如通過(guò)添加包封劑,、抗黏劑,，潛在地改善粉體粘性和吸濕性等。

制備液相色譜/Flash系統(tǒng)純化方法可靠性評(píng)估：

進(jìn)行5次重復(fù)進(jìn)樣,，通過(guò)制備色譜純化,，使用HPLC方法檢測(cè)各餾分中紅榿木素的含量。上表列出了單次純化工藝中,，含最高紅榿木素濃度餾分的分析結(jié)果,，包括紅榿木素回收率百分?jǐn)?shù)和純度（按單個(gè)餾分中紅榿木素峰面積除以所有峰面積計(jì)算），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,。紅榿木素主要分布在Flash純化后的兩組餾分中,，兩組純度分別為 85.35% (3.11% RSD) 和 95.83% (1.00% RSD)。合并兩個(gè)餾分后,，平均回收率為 90.25% (2.33% RSD),。上述結(jié)果RSD%都小于5%,表明采用的純化方法對(duì)測(cè)定回收率和純度都具有出色的可重現(xiàn)性。為了驗(yàn)證根據(jù)峰面積判定純度的準(zhǔn)確性,，紅榿木素純度>95%的餾分液被干燥,，通過(guò)HPLC方法，參照標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紅榿木素的含量測(cè)定,。

使用 80g 和 120g 的商品 Flash 柱,，考察不同進(jìn)樣量和流速對(duì)活性物質(zhì)分離的影響。80g Flash 色譜柱子的上樣量和流速為 10mL,、40mL/min,；120g 柱子的上樣量和流速為 15mL、60mL/min,。上圖顯示了 280nm 檢測(cè)波長(zhǎng)下,，紅榿木素 Oregonin 在制備液相/Flash系統(tǒng)的分離情況，可以看出兩種色譜柱,，兩種進(jìn)樣量,，紅榿木素都有著相似而且較好的分離結(jié)果，出峰時(shí)間 10-15min,。紅榿木素在 120g 色譜柱的洗脫時(shí)間比 80g 色譜柱稍晚（分別為餾分 8-10 與餾分 6-8）,，但這細(xì)微的差異可能是由于色譜柱填料的系統(tǒng)誤差造成的，并不影響方法穩(wěn)定性以及工藝放大可能性。

07 結(jié)論

通過(guò)本研究,，可以使用簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的水提取工藝,，最大限度地減少有機(jī)溶劑的使用；噴霧干燥高效快速地去除提取溶劑,，使紅榿木素產(chǎn)率達(dá) 70% 以上,，降解率也控制在 10% 以內(nèi)；制備色譜純化方法驗(yàn)證中,，各項(xiàng)指標(biāo)的 RSD 均在規(guī)定的 5% 以內(nèi),，同時(shí)也可純化得到純度達(dá) 95% 以上的二芳基庚烷類紅榿木素?？梢?jiàn)通過(guò)改良傳統(tǒng)萃取方法,，采用噴霧干燥和制備色譜聯(lián)用技術(shù)，有利于實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物從小試擴(kuò)大到生產(chǎn)工藝中,。

瑞士步琦公司能為您提供天然藥物分離純化,、萃取、濃縮,、干燥,、制劑&造粒、檢測(cè)及質(zhì)量監(jiān)控等最優(yōu)解決方案,。我們的解決方案能夠與工作流程進(jìn)行完美的整合,，從而最大程度地節(jié)省時(shí)間，提高工作效率,。

應(yīng)用文獻(xiàn)來(lái)源：Efficient purification of the diarylheptanoid oregonin from red alder (Alnus rubra) leaves and bark combining aqueous extraction, spray drying and flash-chromatography