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小角X-射線散射廣泛應(yīng)用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)來確定蛋白質(zhì)的尺寸和形狀,。溶液中的生物大分子可以以多種構(gòu)象存在，并且一般具有很強(qiáng)的團(tuán)聚傾向,，在沒有預(yù)先純化的情況下,，對此類分子的數(shù)據(jù)解釋有時會很繁瑣。
分子排阻凝膠色譜 (SEC) 能夠根據(jù)分子的大小進(jìn)行分離,。SEC 與SAXS 聯(lián)用可以顯著提高數(shù)據(jù)質(zhì)量,，從而提高數(shù)據(jù)解釋的準(zhǔn)確性。
簡介
小角X-射線散射 (SAXS) 是生物化學(xué)等大分子樣品研究中常用的方法,。在過去的幾年里,，由于光束傳輸（第3代和第4代同步加速器、現(xiàn)代實驗室X-射線源）,、探測技術(shù)和數(shù)據(jù)解析方面的進(jìn)步,，SAXS 測量取得了顯著的增長。
在現(xiàn)代同步加速器設(shè)備中,，分子排阻凝膠色譜 (SEC) 是在SAXS線站上建立的一種制備方法,。尺寸不同的分子混合物（如單體、二聚體等）經(jīng)過SEC純化,，可以得到單分散組分,。其基本原理是不同尺寸的大分子在多孔色譜樹脂上的停留時間不同。因此,，大分子比小分子的洗脫速度快,，使得按大小將單個的餾分分開。SEC實驗通常是通過紫外吸收測量來確定哪個時間哪個組分被洗脫,。
實驗室儀器的最新進(jìn)展（如基于液態(tài)金屬靶材或高功率的封閉靶等高性能SAXS儀器）使得這種方法也可以適用于實驗室設(shè)備,，為研究和常規(guī)測量提供了更多的可能性。
這里我們所示的SEC-SAXS 聯(lián)合實驗是在安東帕的SAXSpace儀器上對HSA蛋白樣品進(jìn)行的,，以說明在實驗室儀器上進(jìn)行測量的潛力,。
實驗細(xì)節(jié)和討論
使用標(biāo)準(zhǔn)的FPLC系統(tǒng)和安東帕SAXSpace儀器搭建在線SEC–SAXS 。由于在線測量的性質(zhì),，樣品的特定組分從SEC柱中洗脫時直接測量,。
利用現(xiàn)代實驗室SAXS儀器的高通量，可以在短時間內(nèi)獲得足夠好信噪比的蛋白質(zhì)散射數(shù)據(jù),。
圖 1: SEC-SAXS 裝置所示 SAXSpace 儀器 (前)
和 GE ?kta Pure 25 (后)
通過將人血清白蛋白HSA溶解到緩沖溶液中,，制備了人血清白蛋白樣品溶夜。所使用的緩沖溶液 (pH 7.5) 組分為20 mM 三（三（羥甲基）氨基甲烷）,、150 mMol NaCl和3 % 的甘油,。最終HSA濃度為20 mg/mL,。
樣品在注射到SEC柱之前沒有經(jīng)過進(jìn)一步的純化。使用GE ?kta Pure 25 FPLC儀器進(jìn)行了分子排阻色譜分析,。表1總結(jié)了SEC實驗詳細(xì)設(shè)置參數(shù),。
表 1: SEC 測量的實驗設(shè)置
SAXSpace 儀器的FlowCell中的管子可直接連接到?kta Pure 25 SEC 儀器UV 傳感器的出口，以盡量減小管子長度,。
樣品已注射到SEC柱上,，沒有進(jìn)一步凈化。對于SEC運(yùn)行,，得到圖2所示的色譜圖,。單體的信號（尖銳強(qiáng)峰）和低聚物的信號（主信號前的小峰）可以清楚地識別出來。
圖 2: HAS蛋白樣品的SEC色譜圖,。 單體峰位由灰色虛線表示,。單體洗脫前的峰對應(yīng)不同的低聚物
SAXS測試是使用安東帕SAXSpace儀器進(jìn)行的。表2總結(jié)使用的實驗參數(shù),。
表 2: HAS蛋白SEC-SAXS測試的實驗設(shè)置
對單體蛋白質(zhì)分子的原始散射數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的分析,。確定了單體洗脫峰的散射曲線，并取其平均值,?？偣驳玫搅诉@個區(qū)域內(nèi)具有恒定散射曲線的10幀數(shù)據(jù)。然后使用 SAXSanalysis 軟件對這10幀數(shù)據(jù)進(jìn)行平均并進(jìn)行背景扣除（圖 3a）
即使在總共只有100 s的極短曝光時間內(nèi),，也能獲得極好的數(shù)據(jù)質(zhì)量,。這允許使用SAXSanalysis 對散射曲線進(jìn)行Guinier外推來計算回轉(zhuǎn)半徑（Rg）。
Rg值為2.8 nm,，這與文獻(xiàn)值吻合較好,。
為了獲得實空間結(jié)構(gòu)的信息，利用GIFT軟件對散射曲線進(jìn)行了傅里葉變換,。圖 3b所示的是對距離分布函數(shù)（pddf）結(jié)果,，顯示的是dmax約為10.4 nm的典型單分散蛋白結(jié)構(gòu)的pddf。
圖3：（a）實驗測試散射曲線與GIFT軟件擬合曲線吻合
（b）GIFT軟件的IFT計算的對距離分布函數(shù)PDDF曲線
結(jié)論
在實驗室儀器如安東帕SAXSpace和SAXSpoint等儀器上使用在線SEC-SAXS大大提高了在自己實驗室進(jìn)行蛋白質(zhì)分析的可能性,。
即使是具有很強(qiáng)團(tuán)聚傾向的蛋白質(zhì)也很容易被測定,，因為分離和測定之間沒有延遲。由于測量可以在停止流動模式下,，因此也可以測量高度稀釋低聚物和弱散射小分子,。
這進(jìn)一步減少了同步加速器測量的需求，減少了旅行時間和敏感樣品的運(yùn)輸,。
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