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Aurizio 等人1在研究聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)作為給藥系統(tǒng),，以保護不穩(wěn)定的前藥 LD-LA （治療帕金森病癥狀）免受酶促和化學(xué)降解,，并獲得完整化合物的持續(xù)釋放的過程中,，采用 AccuSizer A7000 對微球粒徑大小和粒徑分布進行檢測,。本文梳理整合《Preparation and characterization of poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres loaded with a labile antiparkinson prodrug》中使用 AccuSizer A7000 對微球粒徑大小和粒徑分布進行檢測的實驗方法和實驗結(jié)果用以參考,。
1引言
帕金森病 (PD) 是一種進行性神經(jīng)退行性疾病,，其主要病理特征為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺( dopamine，DA) 能神經(jīng)元進行性變性丟失,，導(dǎo)致紋狀體 DA 水平下降,，在臨床上主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運動遲緩,、肌強直和姿勢平衡障礙等癥狀,。
PD 的病因?qū)W具有多因素,，包括氧化應(yīng)激和腦鐵失調(diào)。目前的化學(xué)療法基本上是使用外源性左旋多巴 (LD)（DA 的直接前體）作為藥物進行對癥治療,。然而,，LD 給藥與三個重要問題有關(guān)：
① LD 代謝可產(chǎn)生細胞毒性自由基，破壞尚未受損的黑質(zhì)紋狀體的多巴能神經(jīng)元,，可加速帕金森病的發(fā)展,；
② LD 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生物利用度較低；
③ 在長期治療期間,，給藥后 LD 的血藥濃度波動明顯,，進而導(dǎo)致大腦內(nèi)突觸間隙的多巴胺水平波動劇烈，對突觸后多巴胺受體造成脈沖樣刺激,，從而導(dǎo)致運動并發(fā)癥的出現(xiàn),。
為了克服這些問題，最近合成了一種含有 LD 和天然硫辛酸部分（LA）的多功能前藥（LD-LA,，圖 1）,。硫辛酸很容易穿過血腦屏障 ( BBB ) 并在神經(jīng)元中積累，具有抗氧化和鐵螯合特性,，可以減少兒茶酚胺的自動氧化（由過渡金屬加速）和清除 LD 代謝產(chǎn)生的 ROS ,。
LD-LA 對帕金森病癥狀的活性及其抗氧化效率已通過體外和體內(nèi)研究得到證明。此外,，與 LD 相比,，口服 LD-LA 延長了 LD 血藥濃度，因此這種前藥在治療與 LD 血漿水平波動直接相關(guān)的運動并發(fā)癥特別有益,。然而,，LD-LA 兒茶酚酯和酰胺鍵在化學(xué)和酶促作用下均被裂解，導(dǎo)致血漿半衰期約為 50 分鐘,。因此,，每天需要多次給藥以保持 LD 的有效腦水平。
在目前的工作中,，將不穩(wěn)定的前藥 LD-LA 包埋在可生物降解的聚合物微球中,，以保護該前藥免受酶促和化學(xué)降解，并獲得完整化合物的持續(xù)釋放,。聚乳酸-羥基乙酸( PLGA ) 具有良好的生物相容性和可生物降解性，用于制備載有前體藥物的微粒,。因此,，它已被用于開發(fā)低分子量化合物以及治療性蛋白質(zhì)和質(zhì)粒 DNA 的持續(xù)藥物制劑,。
由于 LD-LA 的親脂特性，PLGA 微球采用水包油乳液/溶劑蒸發(fā)法配制,。研究了配方和加工參數(shù)對微球特性（大小,、負載、釋放）的影響,。還強調(diào)了藥物釋放前后的穩(wěn)定性以及控制 LD-LA 釋放的潛在傳質(zhì)機制。
2儀器設(shè)備
AccuSizer顆粒計數(shù)器
品牌：美國PSS（Entegris）,，AccuSizer A7000系列
原理：單個粒子通過狹窄的光感區(qū)時阻擋了一部分入射光,，引起到達檢測器的入射光強度瞬間降低，強度信號的衰減幅度理論上與粒子橫截面(假設(shè)橫截面積小于光感區(qū)的寬度)，即粒子直徑的平方成比例,。用標準粒子建立粒徑與強度信號大小的校正曲線。儀器測得樣品中顆粒通過光感區(qū)產(chǎn)生的信號,，根據(jù)校正曲線計算出顆粒粒徑,。PSS（Entegris）的SPOS單粒子光學(xué)傳感技術(shù),，通過光散射增加對小粒子的靈敏度，將單顆粒傳感器的計數(shù)下限拓展至0.5μm,。A7000AD 采用自動稀釋模式,，可有效將高濃度樣品快速稀釋至合適濃度并進行檢測,。
檢測關(guān)鍵點：濃度,、稀釋液/分散液性質(zhì),、流速,。
3樣品制備及表征
通過油包水乳液/溶劑蒸發(fā)技術(shù)(O/W,，ESE)制備了LD-LA PLGA微球(Wischke和Schwendeman,，2008)。簡單地說,，將 PLGA 和 LD-LA 以不同的濃度和藥物/聚合物比例(PLGA/mL DCM 為200,、400,、800 mg/mL DCM,；藥物/聚合物比例為2%,、5%或20%(w/w))溶解在DCM中,，可制得 0.5 mL的油相,。
對于聚合物濃度較高的溶液,，在室溫下超聲處理 30 min。使用均質(zhì)機,，將 o-ph 與含 PVA 2%(w/w)的水相( aq-ph )乳化(30 s,，室溫,，25000分鐘?1)。將得到的乳液滴入PVA水溶液(0.5% (w/w))中;2.5 或 5 ml)，硬化浴( hb ),，在室溫下磁力攪拌兩小時,，使DCM蒸發(fā)和微球凝固,。
或者，在不稀釋的情況下攪拌乳液(表1),。在室溫(3min,，3000×g)下離心收集微球,，然后用水洗兩次,，用液氮迅速冷凍，冷凍一夜進行干燥,。
使用 AccuSizer A7000 AD 對微球粒徑分布進行表征分析,，使用顯微鏡掃描電鏡（SEM）對 AccuSizer 測量的微球粒徑大小結(jié)果進行佐證,。
4實驗結(jié)果
該實驗考察了配方參數(shù)(聚合物在有機溶劑中的濃度,、相體積比,、有機溶劑蒸發(fā)速率)對微球粒徑大小的影響。表 1 顯示,，PLGA 濃度的增加導(dǎo)致微球尺寸和多分散性增加(例如比較 F2 和 F4),。這些現(xiàn)象可歸因于油相粘度的增加導(dǎo)致攪拌效率的降低,，從而產(chǎn)生多分散和更大的乳化液滴，從而產(chǎn)生尺寸范圍相當寬的微球,。
為獲得可儲存的注射劑,，通常粒徑范圍控制在20-100 μm，上述所有的配方都達到目標粒徑范圍,。微球的多分散性與乳液基的制備技術(shù)相關(guān)。Accusizer 測量（圖 2）表明,，使用 200 mg PLGA/mL 的 DCM 溶液制備的微球具有相當窄的粒徑分布,，而隨著聚合物濃度的增加 (800 mg/mL)，粒徑范圍變寬,。
使用具有高 PLGA 濃度 (800 mg/mL) 的 DCM 溶液制備的顆粒是無孔的，且與 AccuSizer 數(shù)據(jù)（圖 2）一致,，顯示出相當寬的粒徑分布（圖 3,，F(xiàn)8）,。
5結(jié)論
關(guān)鍵配方和加工參數(shù)會影響微球的粒徑大小和孔隙率，從而影響藥物釋放速率,。有機相中的聚合物濃度,、相體積比和水相與有機溶劑的預(yù)飽和度對攪拌效率和油滴凝固速率具有重要影響，從而影響微球粒徑大小,、多分散性和孔隙率,。使用AccuSizer A7000 系列可快速,、準確測量粒徑大小和粒徑分布、從而篩選配方,，節(jié)省研發(fā)時間,。
參考資料
1 E. D’Aurizio, C.F. van Nostrum, M.J. van Steenbergen, P. Sozio, F. Siepmann, J. Siepmann,W.E. Hennink, A. Di Stefano,；Preparation and characterization of poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres loaded with a labile antiparkinson prodrug.
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