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在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,，由于樣品的各種性質(zhì)差異，只有選擇了正確的離心方法,，才能獲得預(yù)期的分離純化結(jié)果,。常用的離心方法主要有差速離心法、密度梯度離心法,。其中密度梯度離心法又可細(xì)分為速率區(qū)帶離心和等密度梯度離心法,。本期向大家具體介紹離心方法之差速離心。
離心方法之差速離心
差速離心法(differential velocity centrifugation method)又稱離心力差分離法,。
差速離心法原理
利用樣品中各組分沉降系數(shù)的差異,，對(duì)不同的微粒施以不同的離心力，經(jīng)過(guò)多次離心,，離心速度逐步加大,，將不同的微粒依次沉降，從而實(shí)現(xiàn)離心分離,。
差速離心原理可用離心力表達(dá)式說(shuō)明：F=ma,， 其中 a=ω2R。
由于小粒徑的微粒質(zhì)量小,，分離時(shí)所需離心力大,。為滿足大離心力的需要，必需提高其旋轉(zhuǎn)速度,，方可分離,。以不同的離心力分離不同粒徑的微粒是動(dòng)力學(xué)的分離方法，特別是沉降速度差別較大的微粒多采用此種分離方法,。
如果分離樣品中有大中小三種不同粒徑的微粒,，對(duì)它們施以不同的離心力，大粒徑的微粒,，其質(zhì)量較大，將會(huì)首先沉降,；分離上清液,，以更大轉(zhuǎn)速對(duì)上清液進(jìn)行第二次離心,，中顆粒被分離出來(lái)；再取上清以更大離心力,，更高的轉(zhuǎn)速,，最后沉降小顆粒，以達(dá)到不同顆粒的分離,，如圖1所示,。
圖1差速離心
由于在每種顆粒的沉淀物中總含有部分次級(jí)顆粒，如想將某種顆粒提純,，需對(duì)該顆粒的沉淀物進(jìn)行稀釋后再離心沉淀,，最終可制備出理想純度的顆粒。
差速離心法之優(yōu)劣勢(shì)
差速離心主要用于分離直徑和密度差異較大的顆粒,，其優(yōu)勢(shì)在于分離時(shí)間短,、重復(fù)性高，樣品處理量大,，可用于大量樣品的初分離,。
但是在使用差速離心法分離復(fù)雜樣品時(shí)，或分離純度要求較高時(shí),，會(huì)需要多次進(jìn)行離心,，操作繁雜；其次,，由于沉淀的多次清洗,、溶解及再沉淀，容易引起中間損失,，會(huì)造成離心分辨力差的問(wèn)題,；此外，實(shí)際分離時(shí)由于離心時(shí)的對(duì)流,、擴(kuò)散和收取沉淀時(shí)的污染,，對(duì)于一些沉降系數(shù)相差不大的組分無(wú)法進(jìn)行完全的分離提純。由于差速離心法在樣品的純度和回收率方面的限制,，它主要用于用于大量樣品的初步分離提純,，為下一步檢測(cè)或?qū)嶒?yàn)做準(zhǔn)備。
例如,，我們可以對(duì)動(dòng)物肝組織勻漿液進(jìn)行多次的不同相對(duì)離心力和時(shí)間的離心和沉淀/上清分步收集,，得到樣品的細(xì)胞核、線粒體,、溶酶體和核糖體等的初步分離富集沉淀,，用于下一步的其他檢測(cè)或者精細(xì)純化實(shí)驗(yàn)。具體的處理流程如下：
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