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【熱點(diǎn)應(yīng)用】高級多檢測器SEC表征腺相關(guān)病毒載體的方法

馬爾文帕納科 2021-12-27 | 閱讀：3084

基因治療是生物制藥行業(yè)中一個快速增長的領(lǐng)域,，通過基因治療可實(shí)現(xiàn)疾病的治療或預(yù)防,。其中，重組腺相關(guān)病毒(rAAV)是目前基因治療領(lǐng)域研究較多的一類病毒載體,。
腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成員之一,，一般，研究中采用的重組腺相關(guān)病毒載體（Recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非致病的野生型AAV基礎(chǔ)上改造而成的基因載體,，由于其種類多樣,、免疫原性極低、安全性高,、宿主細(xì)胞范圍廣,、擴(kuò)散能力強(qiáng)、體內(nèi)表達(dá)基因時間長等,，rAAV被視為最有前途的基因研究和基因治療載體之一,。
目前，rAAV的準(zhǔn)確定量分析和表征的難度是阻礙基因治療快速發(fā)展的關(guān)鍵因素,。我們常常需要對rAAV進(jìn)行綜合全面表征,，比如衣殼數(shù)量、實(shí)心率,、顆粒尺寸,、聚集體比例等。傳統(tǒng)情況,，rAAV滴度和病毒載量采用ELISA,、ddPCR、AUC和EM等技術(shù)進(jìn)行測量。但這些方法通常費(fèi)時費(fèi)力,，而且精確度不高,。
本文通過GPC/SEC和多角度動態(tài)光散射（MADLS）兩種分析技術(shù)分析rAAV5樣品，展示了快速,、準(zhǔn)確和可靠地定量測量AAV的病毒滴度（AAV Titer）和實(shí)心率(% full AAV)的方法,。

01儀器參數(shù)
OMNISEC GPC/SEC多檢測器系統(tǒng)非常適合于生物醫(yī)藥行業(yè)，可用于全面表征rAAV樣品,。OMNISEC包含一個示差折光檢測器(RI),，紫外線全波長陣列檢測器(UV-Vis 190-900 nm)和光散射檢測器，僅需一次進(jìn)樣,，可精確測量絕對分子量,、聚集體比例、病毒滴度和實(shí)心率,。
與傳統(tǒng)HPLC不同,，測量過程不依賴柱保留體積，也不需要一系列標(biāo)樣進(jìn)行色譜柱校正,。圖1顯示了使用OMNISEC測量的CQA關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù),。

02檢測方法
我們采用Empty和Full rAAV5兩個樣品作為分析案例。Full rAAV5 載有已知分子量為785 kg/mol的PFB-GFP ssDNA,。經(jīng)qPCR和ELISA測量方式可知,，該樣本的病毒滴度為2.5x10¹³。
采用色譜柱P4000和P3000串聯(lián),，對rAAV樣品的進(jìn)行色譜分離,。由OMNISEC軟件采集分析測試結(jié)果，其中硬件系統(tǒng)包含OMNISEC RESOLVE(包含泵,、自動進(jìn)樣器和柱溫箱)和OMNISEC REVEAL（包含示差,、UV/PDA和直角90°/小角7°光散射檢測器）。

樣品經(jīng)過分離洗脫后,，使用共聚物分析方法確定樣品兩種不同組分的濃度和分子量,。計(jì)算方法如下：

其中，Conc_Capsid是衣殼濃度(mg/mL),，NA是阿伏伽德羅數(shù),，Mw_capsid是衣殼的分子量(g/mol)，Conc_DNA是DNA濃度(mg/mL),，MwSeq_DNA是來自序列的ssDNA的分子量,。因此，通過計(jì)算出的顆粒濃度,，可以很容易地得出樣品實(shí)心率的百分比,。

03檢測結(jié)果
案例一：
圖2顯示了Empty rAAV5的三檢測色譜圖,。RI信號由紅色曲線表示，260 nm紫外信號由紫色曲線表示,，直角光散射(RALS)信號由綠色曲線表示。樣品包含四個部分：單體峰保留體積(RV)在12.5ml,，碎片在16ml ,，二聚體在10.5ml ，聚集體在8.5ml ,。使用共聚物分析方法,，可以得到表1結(jié)果。

單體的分子量為3.84×10⁶g/mol,。衣殼的理論分子量為3.8×10⁶g/mol,，證實(shí)分析結(jié)果與預(yù)期相符。
M_W/M_n為分子量分布,，描述了樣品的分散性,，單體和二聚體的值接近1，而聚集體和片段均顯著高于1,，表明在同一峰內(nèi)有多個不同分子量的組分,。
Fraction of Sample表示樣品組分百分含量，單體所占百分比為84.7%,。
Fraction of Protein顯示了樣品中衣殼的百分比,，單體包含99.8%的衣殼。這證實(shí)了樣本確實(shí)是Empty rAAV5,。
最后Empty rAAV5樣品總滴度為5.91x10¹³Vp/ml,。

案例二：
第二個樣品Full rAAV5的三檢測器色譜圖如圖3所示。圖中顯示了與Empty rAAV5截然不同的色譜峰,。分析色譜圖可以看出,，只包含兩個不同的組分，其中單體峰,，大概12.5ml RV處,，包含F(xiàn)ull 和Empty rAAV5的混合物，而聚集體出現(xiàn)在8ml RV處,。測試結(jié)果見表2,。

對于主體的單體峰，計(jì)算出其混合物分子量為4.49×10⁶g/mol,，其中86%為衣殼,。rAAV5的蛋白質(zhì)組分的分子量為3.89×10⁶g/mol，這與表1中Empty rAAV5 的數(shù)據(jù)一致,。單體是總體的93.2%,，樣本的總滴度為7.48x10¹³VP/ml。其中單體包含78% Full rAAV5，22% Empty rAAV5,。需要注意的是,，這種分析方法假設(shè)樣品要么是Full ，要么是Empty ,，忽略部分裝載或過度裝載情況,。
Zetasizer Ultra納米粒度及電位儀可以使用MADLS方式快速確定病毒滴度。從OMNISEC獲得的數(shù)據(jù)與Zetasizer Ultra的粒子滴度進(jìn)行了比較,，兩種技術(shù)之間有很好的相關(guān)性,，見圖4。

另外,，本文將Full rAAV5和Empty rAAV5以確定比例混合,，來對Full rAAV5樣品進(jìn)行分析。表3顯示了每個樣品的預(yù)期值和實(shí)際值Full rAAV百分比,。圖5顯示了期望值和實(shí)際值之間有很強(qiáng)的相關(guān)性,，證實(shí)了OMNISEC確定樣品實(shí)心率結(jié)果的可靠性。

為了進(jìn)一步評估OMNISEC對rAAV樣品準(zhǔn)確表征能力,，我們進(jìn)行了rAAV5樣品的熱應(yīng)力穩(wěn)定性研究,，同時，基于ZS Ultra對聚集體的極高靈敏度,，我們利用了ZS Ultra表征rAAV5聚集體的微小變化,。測試條件是將rAAV5樣品置于25^oC到80^oC之間進(jìn)行測試。

在不斷加熱過程中,，在每個溫度下測量rAAV5樣品的粒徑,。在25^oC和35^oC之間，沒有觀察到粒徑的變化,。從35^oC開始,，可以觀察到粒徑開始增大，這表明樣品開始發(fā)生變化(圖6A),。30^oC和45^oC下的數(shù)據(jù)比較清楚地顯示了這些樣品之間的大小差異(圖6B),。我們選擇45^oC條件，對OMNISEC進(jìn)行進(jìn)一步穩(wěn)定性研究,。
將rAAV5樣品在穩(wěn)定在45^oC,，分別在2min 、5min,、10min和15min后,，取樣品到OMNISEC上測試。圖7色譜疊加圖顯示樣品發(fā)生了明顯的變化,，聚集體百分含量增加,，單體濃度含量降低,。表4顯示M_W在此潛伏期內(nèi)保持穩(wěn)定，單體峰中的AAV百分比也保持穩(wěn)定,。

結(jié)論：
在這項(xiàng)研究中,，我們展示了OMNISEC和Zetasizer Ultra在綜合分析表征rAAV5樣品的能力，以及將兩者聯(lián)合使用的應(yīng)用價值,。
OMNISEC多檢測SEC系統(tǒng)將示差折光檢測器,、紫外全波長檢測器、光散射檢測器集成一體化設(shè)計(jì),，具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確度，通過一次進(jìn)樣分析,，可提供各種血清型AAV樣品的絕對分子量,、衣殼大小、滴度,、實(shí)心率,、聚集體、片段和樣品穩(wěn)定性等關(guān)鍵質(zhì)量屬性,。雖然這些參數(shù)中很多都可以使用傳統(tǒng)的生物化學(xué)方法來確定,，但OMNISEC提供了更為簡單、可靠的方法,，正逐漸成為一種表征分析AAV通用的技術(shù)工具,。

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