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【瑞士步琦】【應(yīng)用】運用帶有ELSD和UV雙檢測器的Pure系統(tǒng)快速純化各種范圍的多肽

步琦 2025-04-01 | 閱讀：313

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運用Pure系統(tǒng)

快速純化各種范圍的多肽

Pure應(yīng)用

簡介

肽序列的新發(fā)現(xiàn)為現(xiàn)代醫(yī)學提供了新的藥物開發(fā)候選,。天然產(chǎn)物和合成肽的純化過程是藥物開發(fā)過程中必不可少的步驟,，通常使用制備型 HPLC 來完成，這可能既昂貴又耗時。Flash 快速制備色譜是純化合成肽和其他小分子藥物的快速且經(jīng)濟高效的方法,。使用 Flash 快速制備色譜可以快速增加肽的總體純度,，然后再添加下一個氨基酸或在制備型 HPLC 上進行最終精制。

這項工作證明了使用具有 ELSD 和 UV 檢測功能的 Pure 色譜系統(tǒng)可以純化和回收多種肽,。與制備型 HPLC 色譜柱相比,，F(xiàn)lashPure C18 柱顯示出高負載能力和高分離度的肽純化能力，單次進樣可處理更多量的肽,。并且與制備型 HPLC 相比,，F(xiàn)lash 快速制備色譜減少了純化時間和溶劑使用量。

實驗

通過這項工作,，我們開始測試Flash快速制備色譜是否對純化多種肽有任何優(yōu)勢,。所以，我們選擇肽樣品的大小范圍從幾個氨基酸到長度為32個氨基酸,。為了測試裝載能力的優(yōu)勢,，我們在 12g FlashPure C18、60?,， 40μm 柱子中裝載了 30mg–1g 多肽抗生素（多粘菌素B硫酸鹽）,。

接下來，我們測試了 Pure 快速純化的能力,，以充分混合在分離肽和小氨基酸（?；撬幔?5mg）+萬古霉素（45mg）+多粘菌素（56mg）。

樣品：

多肽,，氨基酸和多肽抗生素（Sigma Aldrich）

合成肽混合物（California Peptide Research, Inc）

設(shè)備：

Pure 分離純化系統(tǒng)（BUCHI）

耗材：

Flash Pure C18（BUCHI）

結(jié)果與討論

評估60?,，40μm C18色譜柱的載樣能力

為了測試載樣能力，將 30mg–1g 的多粘菌素B硫酸鹽裝入12g FlashPure C18 中,，通常來講 HPLC 的典型制備上樣量為柱子填料量的 0.1- 1.0％,。而快速純化載樣數(shù)據(jù)表明，可加載 0.1–10％的樣品而不會對色譜柱產(chǎn)生不利影響,。這意味著與通常需要多次進樣的單獨制備型HPLC相比,，使用快速純化可以在一次進樣中處理更大量的粗肽。與此同時,，可以使用更少的溶劑和更少的時間來純化大量的樣品,。Pure 純化系統(tǒng)的另一個優(yōu)勢是能夠使用干法上樣方式為低溶解度樣品提供更高的負載量。

▲ Polymyxin B 的快速純化載樣數(shù)據(jù)表明,，上樣量可達分離柱質(zhì)量的 0.1–10％,，而對回收率沒有不利影響。

評估多肽混合物的分離

包含兩個多肽（萬古霉素和硫酸多粘菌素B）和一個小氨基酸（?；撬幔┑臏y試混合物證明了 Pure 快速純化系統(tǒng)能夠充分分離肽混合物的能力,。結(jié)果表明,，使用 60?，40μm C18 介質(zhì)進行快速純化可充分分離出三種具有對稱峰形的化合物,。UHPLC證實了萬古霉素和硫酸多粘菌素B的純度均高于 98％,。混合物在10分鐘內(nèi)純化,，這比使用制備型 HPLC 純化相同混合物快約4倍,。除此之外，結(jié)合了 UV 和 ELSD 雙檢測器系統(tǒng)的另一個好處是,，可以檢測和收集未反應(yīng)的氨基酸片段和無紫外吸收產(chǎn)物,。以此為例，?；撬醿H被 ELSD 檢測到,。

結(jié)論

結(jié)果表明，Pure 系統(tǒng)與反相 C18 色譜柱的結(jié)合使用可成功用于純化多種從單個氨基酸到大肽的肽段（接近5000 MW）,。根據(jù)圖譜顯示,，Pure 分離純化系統(tǒng)可以單獨使用，也可以在制備型 HPLC 之前用作預(yù)純化步驟,，這可以提高肽段純化過程的效率,。數(shù)據(jù)表明，樣品的上樣量可達到快速色譜柱填料量的 10％,，并使用快速色譜法成功純化,。這意味著，與通常需要多次進樣的單獨制備型 HPLC 相比,，使用快速純化在一次進樣中可以在更短的時間內(nèi)處理大量的粗肽。自動快速色譜的另一個好處是能夠使用干法上樣的進樣技術(shù)為低溶解度的樣品提供更高的負載量,。將 UV 和蒸發(fā)光散射檢測（ELSD）結(jié)合使用的另一個優(yōu)點是,，可以檢測和收集未反應(yīng)的氨基酸片段和無紫外吸收的產(chǎn)物。