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【瑞士步琦】【應用】利用步琦SFC系統(tǒng)純化阿司匹林、苯佐卡因和普魯卡因

【瑞士步琦】【應用】利用步琦SFC系統(tǒng)純化阿司匹林,、苯佐卡因和普魯卡因
步琦  2024-11-07  |  閱讀:605
2.jpg

利用步琦SFC系統(tǒng)純化

阿司匹林,、苯佐卡因和普魯卡因

SFC應用



1



簡介

化學合成常伴有雜質,因產(chǎn)率很少達 100%,,雜質會嚴重影響藥物療效,、安全和質量,所以純化藥物保障其純度和完整性至關重要,,在現(xiàn)代藥物研發(fā)的過程中往往通過色譜法等多種方法純化,。


在上一篇應用文章《利用步琦 SFC 系統(tǒng)純化利多卡因與乙酰氨基酚》中,我們使用超臨界流體色譜(SFC)高效純化了利多卡因和乙酰氨基酚的合成產(chǎn)物,。在此過程中,,我們先使用步琦獨有的 Sepmatix 8x SFC 平行色譜系統(tǒng)快速篩選了色譜柱,之后將其放大到 BUCHI Sepiatec SFC-50 超臨界制備色譜系統(tǒng)上,。本次應用中,,我們依舊會使用同樣的工作流程去純化阿司匹林、苯佐卡因和普魯卡因的合成產(chǎn)物,。


2



實驗設備

  • BUCHI Sepmatix 8x SFC 8通道平行色譜系統(tǒng)

  • BUCHI Sepiatec SFC-50 超臨界制備色譜系統(tǒng)

  • BUCHI PrepPure 硅膠,,5um,250×4.6mm 

  • BUCHI PrepPure 二醇基,5um,250×4.6mm 

  • BUCHI PrepPure 氨基,,5um,250×4.6mm 

  • BUCHI PrepPure 2-EP,,5um,250×4.6mm 

  • HILIC柱,5um,250×4.6mm (Dr. Maisch GmbH)

  • BUCHI PrepPure PEI,,5um,250×4.6mm 

  • BUCHI PrepPure PEI,,5um,250×4.6mm 

  • BUCHI PrepPure CBD,5um,250×4.6mm 

  • 氰基柱,,5um,250×10mm ,,(Dr. Maisch GmbH)

  • BUCHI PrepPure 2-EP,5um,250×10mm 

  • BUCHI PrepPure 二醇基,,5um,250×10mm


3



化學品與樣品

化學品:

  • 二氧化碳 (99.9%) 

  • 甲醇 (≥99%) 

  • 甲醇溶液中 2M 的氨溶液

  • 甲酸(99%)

  • 去離子水

為了安全處理,,請注意所有相應的MSDS!


樣品:

  • 普魯卡因合成產(chǎn)物

  • 阿司匹林合成產(chǎn)物

  • 苯佐卡因合成產(chǎn)物


4



程序設定

BUCHI Sepmatix 8x SFC 平行色譜柱系統(tǒng)

  • 流動相:A= 二氧化碳,;B= 甲醇

  • 柱尺寸:250×4.6mm

  • 流速:3mL/min(每根色譜柱)

  • 檢測:DAD 紫外掃描 200 nm - 600 nm

  • 流動相條件:

0 – 0.5 min

5 % B

0.5 – 8.0 min

5 – 50 % B

8.0 – 9.4 min

50 % B

9.4 – 9.5 min

50 – 5 % B

9.5 – 10 min

5 % B


篩選運行完全自動運行,流速設置為 3mL/min 每通道,,使用流控單元,,平衡每一根色譜柱,。樣品自動注入(V=5μL),并開始平行篩選(運行時間=10min),。背壓調節(jié)器設置為 150 bar,,柱子加熱至 32℃,可按需往改性劑中加入添加劑改善峰型,。


BUCHI Sepiatec SFC-50 超臨界制備色譜系統(tǒng)

  • 流動相:A= 二氧化碳,;B= 甲醇

  • 柱尺寸:250×10mm

  • 流動相條件:等度運行條件

  • 檢測:紫外


所有 10mm ID 色譜柱都在預設流速下平衡 3 分鐘,使用自動進樣器上樣,,并開始運行,。背壓調節(jié)器設置為 150 bar,柱子加熱至 40℃,,可按需往改性劑中加入添加劑改善峰型,。


5



結果

5.1 阿司匹林

阿司匹林,化學名為乙酰水楊酸(下稱 ASA),,是一種眾所周知的鎮(zhèn)痛和抗炎藥物,。它屬于非甾體抗炎藥(NSAIDs)這一類??梢酝ㄟ^將水楊酸(下稱 SA)與乙酸酐發(fā)生酯化反應而化學合成(見圖5) [1] ,。為了確定乙酰水楊酸的理想分離選擇性,首先進行了色譜柱柱篩選(見圖1),。


 圖 1:頂部:阿司匹林合成的反應方程式,,底部:Sepmatix 8x SFC 儀器色譜柱篩選結果;從左到右:硅膠,,氨基,,二醇基,氰基,,2-EP,,HILIC,PEI和CBD,;運行時間 = 10分鐘,。


由于 SA 在固定相中的保留性較高,為了強制洗脫 SA,,在梯度中增加了一個等度步驟,,即在 50% 改性劑濃度下進行 5 分鐘的等度洗脫。在 HILIC 相中,,ASA 和 SA 只有噪音而無洗脫,。在 PEI 相中,在實驗條件下只有 ASA 被洗脫。除氰基相外,,其余各相均顯示出 ASA 和 SA 的分離,。結合分離時長和分辨率而言,2-EP 相的結果最好(見表 1


▲ 表1:樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序


選擇 2-EP 相作為固定相,,放大至制備規(guī)模,。在色譜柱篩選的過程中,ASA 和 SA 在 2-EP上被洗脫的甲醇比例為 26 - 40%,。圖 2(上)顯示了在甲醇比例為 40% 的10x250mm 2-EP 色譜柱上純化 ASA 和 SA 的情況,。改性劑中添加了甲酸(0.5%),以改善 SA 的峰形,。在不添加甲酸的情況下,,SA 的拖尾非常嚴重。在相同條件下,,可采用疊加進樣法自動純化 ASA(見圖2下),,并進行餾分收集。


 圖 2:ASA 純化的單次進樣(上圖)和疊加進樣(下圖),;運行條件:流速 = 30 mL/min,,改性劑 = 甲醇 + 0.5 % 甲酸,改性劑 % = 40 %,,溫度 = 40 °C,,壓力 BPR = 150 bar,進樣量 = 200 μL,,紫外波長 = 254 nm,;疊加進樣條件:進樣次數(shù) = 10,疊加時間 = 2.0 min,,餾分 = 1(基于時間),。


5.2 苯佐卡因

苯佐卡因(下稱 BC),化學名為對氨基苯甲酸乙酯,,屬于局部麻醉劑類,。它可以從對氨基苯甲酸(下稱 PABA)通過酸催化羧基與乙醇的酯化反應化學合成,用硫酸作為催化劑 [2],。首先進行色譜柱篩選,,以確定苯佐卡因合成產(chǎn)物理想的分離選擇性(見 圖3)。


 圖3:頂部:苯佐卡因合成反應方程式,,底部:Sepmatix 8x SFC儀器色譜柱篩選結果,;從左到右:硅膠,氨基,,二醇基,,氰基,,2-EP,HILIC,,PEI和CBD,;運行時間 = 15分鐘。


由于 PABA 在固定相中的保留性較強,,因此在梯度中增加了一個等度步驟,在 50% 甲醇的條件下運行 5 分鐘,,硫酸通過洗滌步驟去除避免過高的酸性,。各固定相的色譜圖顯示,每種固定相都能分離苯佐卡因,,但是洗脫速度和分辨率存在很大差異(見表2),。HILIC 和氨基相的分辨率最高,但 PABA 的保留時間過長,,即使用50%的甲醇洗脫,,依舊需要很長時間。


 表2:樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序,。


結合柱篩選結果,,最終選擇二醇基相作為制備色譜柱。HILIC 和氨基相需要較高比例的甲醇和較長的運行時間,。二醇基相不僅可以非??焖俚叵疵摌悠罚⒕哂凶銐蚋叩姆直媛?。二醇基柱的篩選結果表明,,BC 和 PABA 在甲醇比例為 30 - 40% 時即可洗脫。


圖 4(上圖)顯示了 10 x 250mm 的二醇基色譜柱在甲醇比例為 28% 時對苯佐卡因的純化情況,。在相同條件下,,可采用疊加進樣法自動純化 BC(見圖4下),并進行餾分收集,。


 圖 4:苯佐卡因的單次注射(頂部)和堆疊注射(底部)純化,;運行條件:流速 = 20 mL/min, 改性劑 = 甲醇,,改性劑 % = 28%,,溫度 = 40 °C,壓力 BPR = 150 bar,,注射量 = 90 μL,,UV 波長 =276nm;堆疊注射條件:注射次數(shù) =12,,堆疊時間 =0.66min,,餾分 =1(基于時間的)。


5.3 普魯卡因

普魯卡因(下稱 PC),化學名為 4-氨基苯甲酸 2-(N, N-二乙基氨基)乙酯,,是一種藥物,,具有局部麻醉作用。它阻斷電壓依賴性鈉離子通道,,從而導致例如疼痛敏感性的降低,。普魯卡因可以通過化學方法在堿性條件下從 4-氨基苯甲酸乙酯(下稱ABE)合成。這涉及到使用 2-二乙基氨基乙醇進行酯交換[3],。堿是乙醇鈉醇,,它可以通過鈉與乙醇的反應產(chǎn)生。為確定普魯卡因合成產(chǎn)物純化的理想選擇性,,進行了色譜柱篩選(見圖 5),。


 圖5:頂部:普魯卡因合成的反應方程式,底部:Sepmatix 8x SFC 儀器色譜柱篩選結果,;從左到右:硅膠,,氨基,二醇基,,氰基,,2-EP,HILIC,,PEI 和 CBD,;運行時間 = 15分鐘。


由于普魯卡因在固定相中的保留性較高,,因此在梯度中增加了一個等度步驟,,即在 50% 甲醇濃度下進行 5 分鐘的梯度。結果顯示,,每種固定相對普魯卡因的純化都有合適的選擇性(見表3),。普魯卡因在硅膠、PEI 和氰基固定相中的保留性較高,。


由于普魯卡因的基本特性,,在部分色譜柱上的峰形非常不對稱。二醇基相下的峰前沿非常明顯,,不對稱度系數(shù)為 0.58,,而硅膠相下的拖尾非常明顯,不對稱度系數(shù)為 2.73,。


 表3:樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序,。


結合柱篩選結果,選擇 2-EP 相放大為制備純化的方法,。硅膠相需要高含量的甲醇才能洗脫出 PC,,導致運行時間長,,峰形不佳。而 2-EP 相既可以快速洗脫樣品,,又具有足夠高的分辨率,。為了改善峰型,在甲醇改性劑中加入 5 % 的去離子水和 20 mM 的氨水作為添加劑,。


篩選結果表明,,PC 和 ABE 在改性劑含量約為 24 - 32% 時可以從色譜柱內洗脫下來。圖6(上圖)顯示了10 x 250mm 的 2-EP 色譜柱在改性劑含量為 25% 時純化 PC 的情況,。在相同條件下,,可采用疊加進樣法自動純化 PC(見圖6,下圖)并收集餾分,,添加添加劑可顯著改善 PC 的峰形。


 圖 6:普魯卡因純化的單次進樣(上圖)和疊加進樣(下圖),;運行條件:流速 = 20 mL/min,,改性劑 = 甲醇/水(95/5 %)加 20 mM 氨水,改性劑 % = 25 %,,溫度 = 40 °C,,壓力 BPR = 150 bar,進樣量 = 100 μL,,紫外波長 = 220 nm,;疊加進樣條件:進樣次數(shù) = 10,疊加時間 = 1.1min,,餾分 = 2(基于時間),。


6



結論

超臨界制備色譜純化合成產(chǎn)物高效快速,但需篩選合適的色譜填料,。BUCHI Sepmatix 8x SFC 平行色譜系統(tǒng)可快速篩選填料并放大至制備規(guī)格,,既能提高樣品分離度,又能充分利用色譜柱上樣量,,為 BUCHI Sepiatec SFC-50 制備系統(tǒng)的疊加進樣奠定良好基礎,,二者結合可達到降本增效的目的。


7



參考文獻

  1. Th. Eicher und H. J. Roth; Synthese, Gewinnung und Charakterisierung von Arzneistoffen, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1986).

  2. Winterfeld, K. – Praktikum der organisch-pr?parativen Pharmazeutischen Chemie, 6. Auflage, Steinkopff Verl., Darmstadt (1965).

  3. Axel Kleemann, Jürgen Engel, Bernd Kutscher und Dietmar Reichert: Pharmaceutical Substances, 4. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (2000).




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