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利用BUCHI SFC系統(tǒng)

加速尿嘧啶和黃嘌呤類化合物的制備分離

尿嘧啶和黃嘌呤類物質(zhì),，即咖啡因,、可可堿和茶堿，是一類在各種人類生物活動過程中發(fā)揮重要作用的有機(jī)化合物,。這些分子屬于雜環(huán)化合物類,，其特點(diǎn)是含有既有碳又有氮原子的環(huán)結(jié)構(gòu)。尿嘧啶是 RNA 的基本組成部分,，是構(gòu)成遺傳密碼并參與蛋白質(zhì)合成的核堿基之一,。

另一方面，咖啡因,、可可堿和茶堿這些黃嘌呤類物質(zhì),，是結(jié)構(gòu)相似但具有不同生物效應(yīng)的生物堿。這些黃嘌呤類物質(zhì)存在于各種植物來源中,，是眾所周知的刺激物質(zhì),，能夠穿過血腦屏障并影響中樞神經(jīng)系統(tǒng),，目前成熟且廣泛應(yīng)用的分離方法往往是利用 RP-HPLC（反向色譜法）。

▲ 圖示：利用 YWG C18（150 x 4.6mm,，5μm）色譜柱,，7.5% 甲醇等度，10mmol/L KH2PO4-Na2HPO4 緩沖液（pH 5.0）分離混合物,，紫外檢測波長 260nm,。1.尿嘧啶；2.胸腺嘧啶,；3.腺嘌呤,；4.可可堿；5.尿嘧啶丙酸,；6.茶堿,；7.咖啡因[1]

關(guān)于此類應(yīng)用的反向色譜法已經(jīng)被優(yōu)化到了極致，因此在本文中,，我們想嘗試以不同的方式來分離這些化合物,，找出一個更快、更高效的解決方案,。

SFC（超臨界流體色譜）是一種色譜技術(shù),，其移動相的一個重要組成部分是超臨界二氧化碳。二氧化碳處于超臨界狀態(tài)時具有獨(dú)特的性質(zhì),，如高擴(kuò)散系數(shù)和低粘度,，使其成為化合物分離和分析的優(yōu)良溶劑。SFC 相對于傳統(tǒng)色譜方法具有許多優(yōu)勢,，包括更快的分析時間,、更低的溶劑消耗以及在分離中的差異選擇性。此外,，與 RP-HPLC 相比,，SFC 代表了一種正交技術(shù)，為各種分析挑戰(zhàn)提供了互補(bǔ)的分離能力,。

在 SFC 中,，篩選色譜柱并找到最適合特定分離任務(wù)的固定相，是提高分離度的關(guān)鍵步驟,。固定相是色譜系統(tǒng)的重要組成部分,，因?yàn)樗苯佑绊戇x擇性。不同的固定相具有不同的化學(xué)功能和與樣品相互作用的能力,，使其對特定化合物更具選擇性,。通過篩選和選擇合適的色譜柱，可以優(yōu)化分離條件，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物的更好分辨率和靈敏度,。

本文描述了使用 Sepmatix 8x SFC 平行色譜分析系統(tǒng)對尿嘧啶,、咖啡因、可可堿和茶堿混合物進(jìn)行平行柱篩選,，并隨后將方法放大到制備型 Sepiatec SFC-50 儀器的過程,。

設(shè)備

▲ Sepmatix 8x SFC 超高效平行色譜系統(tǒng)

▲ Sepiatec SFC-50 制備色譜系統(tǒng)

色譜柱

• BUCHI PrepPure 硅膠, 5 um, 250 x 10 mm制備色譜柱

• BUCHI PrepPure 二醇基, 5 um, 250 x 10 mm制備色譜柱

• BUCHI PrepPure PEI, 5 um, 250 x 4.6 mm

• BUCHI PrepPure CBD, 5 um, 250 x 4.6 mm

• BUCHI PrepPure 硅膠, 5 um, 250 x 4.6 mm

• BUCHI PrepPure 二醇基, 5 um, 250 x 4.6 mm

• BUCHI PrepPure 氨基, 5 um, 250 x 4.6 mm

• BUCHI PrepPure 2-EP, 5 um, 250 x 4.6 mm

• Reprosil 4-EP, 5 um, 250 x 4.6 mm (Dr. Maisch GmbH)

• 氰基, 5 um, 250 x 4.6 mm, (Dr. Maisch GmbH)

1 試劑與樣品

• 食品級二氧化碳（99.9％）

• 甲醇（≥ 99％）

• 尿嘧啶（99+％）

• 可可堿（99％）

• 咖啡因（99+％）

• 茶堿（99％）

樣品準(zhǔn)備：在 50/2.5mL 甲醇/水中，溶入50mg 尿嘧啶,，70mg 咖啡因,，55mg 可可堿和85mg 茶堿，需加熱至 40℃,，并配合超聲波輔助溶解,。

2 實(shí)驗(yàn)部分

1、利用 Sepmatix 8x SFC 篩選色譜柱

篩選結(jié)果：

使用 Sepmatix 8x SFC 平行色譜儀器可以高效地同時篩選 8 根柱,。因此,，可以在很短的時間內(nèi)確定最佳選擇性,。為此,，使用了8種不同的固定相：硅膠、氨基,、氰基,、二醇基、2-EP,、4-EP,、PEI 和 CBD（型號請見上文），具體表現(xiàn)請看下圖,。

▲ 圖示：8根不同固定相的色譜柱在分離尿嘧啶,，咖啡因，可可堿和茶堿混合物時的表現(xiàn),。

結(jié)果顯示除了氰基,、2-EP 和 4-EP 相外，所有其他固定相都可以分離樣品,，因此我們需要分析最佳分離度的固定相,。此時，分辨率（R）可以量化分析物之間的分離程度,。

在處理復(fù)雜混合物時,，R 值尤為重要，因?yàn)樗_保每種分析物都能被很好地分離并準(zhǔn)確識別和定量,。R 為 1 表示峰根本沒有分離,，實(shí)質(zhì)上是合并的，而更高的R值表示峰之間的分離更好。在實(shí)踐中,，R 至少為 1.5 通常被認(rèn)為是適合進(jìn)行正確定量和鑒定分析物的,。

• tR2 和 tR1 =組分 1 或組分 2 的保留時間

• W1 和W2 =組分 1 或組分 2 的峰高的一半處的寬度

我們將不同固定相的R值計(jì)算并列入下表進(jìn)行對比：

篩選和 R 值的評估顯示，硅膠,、二醇基和 PEI 相具有最佳的選擇性來分離樣品,，我們需要結(jié)合分離圖譜來篩選合適的固定相。在硅膠柱上,，第一個與第二個峰并未呈現(xiàn)完全的基線分離,。使用 PEI 相時，由于樣品分子的較高滯留性,，運(yùn)行時間相對較長,。而二醇基無論在分離度和時間上都有出色的表現(xiàn)，因此我們最終選擇二醇基作為制備分離時的固定相,，色譜柱為 BUCHI PrepPure  二醇基, 5 um, 250 x 10 mm 制備色譜柱,。

2、使用 Sepiatec SFC-50 制備分離樣品

在 SFC 上,，我們可以通過堆疊進(jìn)樣的形式來制備純化,，其生產(chǎn)率明顯高于通過多次進(jìn)樣進(jìn)行的梯度純化。由于堆疊進(jìn)樣只能在等度條件下進(jìn)行,，因此需要先摸索不同等度比例下樣品分離效果,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

▲ 圖示：33% 等度甲醇，4min 條件下,，尿嘧啶,，咖啡因，可可堿和茶堿混合物的分離效果

▲ 圖示：12% 等度甲醇,，5min 條件下,，尿嘧啶，咖啡因,，可可堿和茶堿混合物的分離效果

由上圖可得知,，33% 的甲醇條件下，尿嘧啶,，咖啡因,，可可堿和茶堿無法被完全分離，而 12% 的甲醇條件下,，樣品分離度非常好,。以此為基礎(chǔ)，我們進(jìn)一步去開發(fā)疊層進(jìn)樣的方法,。

通過 Sepiatec SFC 的智能疊層進(jìn)樣時間推薦,，我們把疊層進(jìn)樣的時間設(shè)置為 2.42 分鐘,，既每 2.42 分鐘一次注入一次樣品，總計(jì) 8 次,，上樣量增加到 0.12mL,。

▲ 圖示：通過 2.42min 間隔的疊層進(jìn)樣在短時間內(nèi)進(jìn)行8次制備分離

▲ 圖示：多次進(jìn)樣的疊加圖片

每次進(jìn)樣的相應(yīng)疊加 UV 信號表明該方法具有良好的重現(xiàn)性，垂直線描述了收集相應(yīng)份數(shù)的時間窗口,。

硅膠色譜柱的分離：

為了與二醇基填料進(jìn)行對比,，我們也嘗試使用硅膠填料進(jìn)行疊層進(jìn)樣與分離，其參數(shù)如下：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

▲ 圖示：通過 2.15 min 間隔的疊層進(jìn)樣在短時間內(nèi)進(jìn)行 7 次制備分離

▲ 圖示：多次進(jìn)樣的疊加圖片

與二醇基相比,，硅膠在 100bar 下表現(xiàn)更好,，時間也更短。但是,，在 R=1.57 的分辨率下,，第一與第二個峰并不能理想地基線分離，會造成部分樣品損失,。

2 結(jié)論

3 參考

1.韓金土, 樂良. 生物堿基及其衍生物的反相離子對色譜行為研究. 信陽師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版）第12卷,，第2期,，1999年4月