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【瑞士步琦】【應用】利用BUCHI SFC系統(tǒng)加速尿嘧啶和黃嘌呤類化合物的制備分離

步琦 2024-03-08 | 閱讀：592

利用BUCHI SFC系統(tǒng)

加速尿嘧啶和黃嘌呤類化合物的制備分離

尿嘧啶和黃嘌呤類物質，即咖啡因,、可可堿和茶堿，是一類在各種人類生物活動過程中發(fā)揮重要作用的有機化合物,。這些分子屬于雜環(huán)化合物類,，其特點是含有既有碳又有氮原子的環(huán)結構。尿嘧啶是 RNA 的基本組成部分,，是構成遺傳密碼并參與蛋白質合成的核堿基之一,。

另一方面，咖啡因,、可可堿和茶堿這些黃嘌呤類物質,，是結構相似但具有不同生物效應的生物堿。這些黃嘌呤類物質存在于各種植物來源中,，是眾所周知的刺激物質,，能夠穿過血腦屏障并影響中樞神經系統(tǒng)，目前成熟且廣泛應用的分離方法往往是利用 RP-HPLC（反向色譜法）,。

▲ 圖示：利用 YWG C18（150 x 4.6mm,，5μm）色譜柱,，7.5% 甲醇等度，10mmol/L KH2PO4-Na2HPO4 緩沖液（pH 5.0）分離混合物,，紫外檢測波長 260nm,。1.尿嘧啶；2.胸腺嘧啶,；3.腺嘌呤,；4.可可堿；5.尿嘧啶丙酸,；6.茶堿,；7.咖啡因[1]

關于此類應用的反向色譜法已經被優(yōu)化到了極致，因此在本文中,，我們想嘗試以不同的方式來分離這些化合物,，找出一個更快、更高效的解決方案,。

SFC（超臨界流體色譜）是一種色譜技術,，其移動相的一個重要組成部分是超臨界二氧化碳。二氧化碳處于超臨界狀態(tài)時具有獨特的性質,，如高擴散系數和低粘度,，使其成為化合物分離和分析的優(yōu)良溶劑。SFC 相對于傳統(tǒng)色譜方法具有許多優(yōu)勢,，包括更快的分析時間,、更低的溶劑消耗以及在分離中的差異選擇性。此外,，與 RP-HPLC 相比,，SFC 代表了一種正交技術，為各種分析挑戰(zhàn)提供了互補的分離能力,。

在 SFC 中,，篩選色譜柱并找到最適合特定分離任務的固定相，是提高分離度的關鍵步驟,。固定相是色譜系統(tǒng)的重要組成部分,，因為它直接影響選擇性。不同的固定相具有不同的化學功能和與樣品相互作用的能力,，使其對特定化合物更具選擇性,。通過篩選和選擇合適的色譜柱，可以優(yōu)化分離條件,，實現目標分析物的更好分辨率和靈敏度,。

本文描述了使用 Sepmatix 8x SFC 平行色譜分析系統(tǒng)對尿嘧啶、咖啡因、可可堿和茶堿混合物進行平行柱篩選,，并隨后將方法放大到制備型 Sepiatec SFC-50 儀器的過程,。

設備

▲ Sepmatix 8x SFC 超高效平行色譜系統(tǒng)

▲ Sepiatec SFC-50 制備色譜系統(tǒng)

色譜柱

BUCHI PrepPure 硅膠, 5 um, 250 x 10 mm制備色譜柱
BUCHI PrepPure 二醇基, 5 um, 250 x 10 mm制備色譜柱
BUCHI PrepPure PEI, 5 um, 250 x 4.6 mm
BUCHI PrepPure CBD, 5 um, 250 x 4.6 mm
BUCHI PrepPure 硅膠, 5 um, 250 x 4.6 mm
BUCHI PrepPure 二醇基, 5 um, 250 x 4.6 mm
BUCHI PrepPure 氨基, 5 um, 250 x 4.6 mm
BUCHI PrepPure 2-EP, 5 um, 250 x 4.6 mm
Reprosil 4-EP, 5 um, 250 x 4.6 mm (Dr. Maisch GmbH)
氰基, 5 um, 250 x 4.6 mm, (Dr. Maisch GmbH)

1 試劑與樣品

食品級二氧化碳（99.9％）
甲醇（≥ 99％）
尿嘧啶（99+％）
可可堿（99％）
咖啡因（99+％）
茶堿（99％）

樣品準備：在 50/2.5mL 甲醇/水中，溶入50mg 尿嘧啶,，70mg 咖啡因，55mg 可可堿和85mg 茶堿,，需加熱至 40℃,，并配合超聲波輔助溶解。

2 實驗部分

1,、利用 Sepmatix 8x SFC 篩選色譜柱

篩選結果：

使用 Sepmatix 8x SFC 平行色譜儀器可以高效地同時篩選 8 根柱,。因此，可以在很短的時間內確定最佳選擇性,。為此,，使用了8種不同的固定相：硅膠、氨基,、氰基,、二醇基、2-EP,、4-EP,、PEI 和 CBD（型號請見上文），具體表現請看下圖,。

▲ 圖示：8根不同固定相的色譜柱在分離尿嘧啶,，咖啡因，可可堿和茶堿混合物時的表現,。

結果顯示除了氰基,、2-EP 和 4-EP 相外，所有其他固定相都可以分離樣品,，因此我們需要分析最佳分離度的固定相,。此時，分辨率（R）可以量化分析物之間的分離程度,。

在處理復雜混合物時,，R 值尤為重要，因為它確保每種分析物都能被很好地分離并準確識別和定量,。R 為 1 表示峰根本沒有分離,，實質上是合并的，而更高的R值表示峰之間的分離更好,。在實踐中,，R 至少為 1.5 通常被認為是適合進行正確定量和鑒定分析物的。

tR2 和 tR1 =組分 1 或組分 2 的保留時間
W1 和W2 =組分 1 或組分 2 的峰高的一半處的寬度

我們將不同固定相的R值計算并列入下表進行對比：

篩選和 R 值的評估顯示,，硅膠,、二醇基和 PEI 相具有最佳的選擇性來分離樣品,，我們需要結合分離圖譜來篩選合適的固定相。在硅膠柱上,，第一個與第二個峰并未呈現完全的基線分離,。使用 PEI 相時，由于樣品分子的較高滯留性,，運行時間相對較長,。而二醇基無論在分離度和時間上都有出色的表現，因此我們最終選擇二醇基作為制備分離時的固定相,，色譜柱為 BUCHI PrepPure 二醇基, 5 um, 250 x 10 mm 制備色譜柱,。

2、使用 Sepiatec SFC-50 制備分離樣品

在 SFC 上,，我們可以通過堆疊進樣的形式來制備純化,，其生產率明顯高于通過多次進樣進行的梯度純化。由于堆疊進樣只能在等度條件下進行,，因此需要先摸索不同等度比例下樣品分離效果,。

實驗結果：

▲ 圖示：33% 等度甲醇，4min 條件下,，尿嘧啶,，咖啡因，可可堿和茶堿混合物的分離效果

▲ 圖示：12% 等度甲醇,，5min 條件下,，尿嘧啶，咖啡因,，可可堿和茶堿混合物的分離效果

由上圖可得知,，33% 的甲醇條件下，尿嘧啶,，咖啡因,，可可堿和茶堿無法被完全分離，而 12% 的甲醇條件下,，樣品分離度非常好,。以此為基礎，我們進一步去開發(fā)疊層進樣的方法,。

通過 Sepiatec SFC 的智能疊層進樣時間推薦,，我們把疊層進樣的時間設置為 2.42 分鐘，既每 2.42 分鐘一次注入一次樣品,，總計 8 次,，上樣量增加到 0.12mL。

微信圖片_20240308114054.jpg

▲ 圖示：通過 2.42min 間隔的疊層進樣在短時間內進行8次制備分離

微信圖片_20240308114057.jpg

▲ 圖示：多次進樣的疊加圖片

每次進樣的相應疊加 UV 信號表明該方法具有良好的重現性，垂直線描述了收集相應份數的時間窗口,。

硅膠色譜柱的分離：

為了與二醇基填料進行對比,，我們也嘗試使用硅膠填料進行疊層進樣與分離，其參數如下：

實驗結果：

▲ 圖示：通過 2.15 min 間隔的疊層進樣在短時間內進行 7 次制備分離

▲ 圖示：多次進樣的疊加圖片

與二醇基相比,，硅膠在 100bar 下表現更好,，時間也更短。但是,，在 R=1.57 的分辨率下,，第一與第二個峰并不能理想地基線分離，會造成部分樣品損失,。

2 結論

在這個應用中,，使用 Sepmatix 8x SFC 平行色譜儀器進行了柱篩選,，并將最佳色譜柱放大到 Sepiatec SFC-50 儀器,。在色譜參數分辨率和運行時間方面，二醇基顯示出最佳結果,。作為對比,，還開發(fā)了一種用于硅膠柱的方法，但分辨率值略低,。這表明,，如果需要用 SFC 制備并獲取大量化合物，通過柱篩選事先確定最佳色譜條件是很重要的,。之后,，該方法可以簡單地放大至制備級 SFC 上，并最終進行優(yōu)化,，配合疊層進樣,，獲取大量樣品。

3 參考

1.韓金土, 樂良. 生物堿基及其衍生物的反相離子對色譜行為研究. 信陽師范學院學報（自然科學版）第12卷,，第2期,，1999年4月