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細(xì)胞計(jì)數(shù)看似簡(jiǎn)單,，但有時(shí)檢測(cè)結(jié)果會(huì)受到來(lái)自樣品的狀態(tài)和儀器的測(cè)試條件等影響,。在此我們使用Vi-CELL BLU 全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀,，結(jié)合96 孔板上樣模式,，通過(guò)在單次實(shí)驗(yàn)中使用不同的檢測(cè)條件,，以此來(lái)評(píng)估對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析的影響。

待分析細(xì)胞

CHO 細(xì)胞（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞）,，EL4 細(xì)胞（小鼠T 淋巴細(xì)胞系）,，SF9 昆蟲細(xì)胞（來(lái)自甜菜夜蛾的卵巢組織）和HELA 細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞）。

分析目的

評(píng)估較長(zhǎng)的分析時(shí)間和不同的樣品制備條件對(duì)這些細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析結(jié)果的影響,。

分析結(jié)果

1CHO細(xì)胞樣品制備的影響

細(xì)胞接種或做其他實(shí)驗(yàn)之前的細(xì)胞換洗和濃縮過(guò)程中,，離心和重懸是常用的方法。

一般認(rèn)為CHO 細(xì)胞是比較好生長(zhǎng)的,，但有時(shí)它們也有特別的生長(zhǎng)要求,，需要專門的培養(yǎng)基才能達(dá)到很好地生長(zhǎng)。以下實(shí)驗(yàn)中,，細(xì)胞通過(guò)1000g 離心5分鐘（相對(duì)溫和的離心）后，在培養(yǎng)基或緩沖液中重懸,，然后評(píng)估樣品制備對(duì)細(xì)胞活率的影響,。

結(jié)果顯示：在推薦的培養(yǎng)基中離心和重懸對(duì)CHO 細(xì)胞沒(méi)有明顯的影響。但是,，在PBS 緩沖液中重懸對(duì)細(xì)胞活率影響較大,，并且平均細(xì)胞直徑也明顯下降。同時(shí),，細(xì)胞密度也有一些小的減少,，可能是重懸過(guò)程中損耗的。在PBS 緩沖液中的第2次離心和重懸對(duì)細(xì)胞活率和細(xì)胞大小也產(chǎn)生了負(fù)面影響,。

圖1,、 CHO 細(xì)胞樣品制備方法的影響

2EL4 細(xì)胞混合次數(shù)分析

EL4 細(xì)胞通常被認(rèn)為是易碎的，即使在理想條件下生長(zhǎng)也很緩慢,，并且活率<70%,。我們制備了EL4 細(xì)胞后，分裝到96 孔板中,。細(xì)胞類型使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞參數(shù),，只是混合次數(shù)有差異。目的是評(píng)估增加混合次數(shù)后細(xì)胞受到混懸和離心破壞的影響有多大,。

結(jié)果顯示：總細(xì)胞計(jì)數(shù)和密度及細(xì)胞直徑都沒(méi)有怎么變化,，但活細(xì)胞數(shù)隨混合次數(shù)增加逐漸下降，因而細(xì)胞活率也相應(yīng)下降,。這表明對(duì)于這類細(xì)胞,，減少樣品吹打混懸和臺(tái)盼藍(lán)染色混合次數(shù)可能會(huì)更適合，過(guò)多的吹打混勻需要避免。

圖2,、EL4 細(xì)胞混合次數(shù)的影響

3SF9 昆蟲細(xì)胞延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間的評(píng)估

即使在理想條件下SF9細(xì)胞生長(zhǎng)要達(dá)到高密度也不容易,，通常活率都在60%以下,。

因此通過(guò)96孔板上測(cè)試使得檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng),，以此評(píng)估可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的負(fù)面影響。我們使用了標(biāo)準(zhǔn)昆蟲細(xì)胞的參數(shù)在96 孔板上對(duì)SF9昆蟲細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè),。

結(jié)果顯示：在檢測(cè)的3個(gè)小時(shí)過(guò)程中,，細(xì)胞活率沒(méi)有大的影響，細(xì)胞直徑也沒(méi)有太大變化,，但如果細(xì)胞死亡或膨脹,，這兩個(gè)參數(shù)是會(huì)變化的。雖然活率較低,，但在離開細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境后比較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)并沒(méi)有不利影響,，所以這些細(xì)胞足夠強(qiáng)壯。

圖3,、 SF9細(xì)胞在較長(zhǎng)一段時(shí)間中表現(xiàn)出的活率和平均直徑

4HELA 細(xì)胞直徑隨時(shí)間的變化

為了脅迫細(xì)胞,，HELA細(xì)胞生長(zhǎng)成高度融合狀態(tài)，然后收集并重懸分散,。將HELA細(xì)胞分裝到96 孔板中,，通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞參數(shù)測(cè)試得到分析結(jié)果。96 孔板按每列測(cè)試,，從而保證每行之間細(xì)胞檢測(cè)間隔時(shí)間是一致的,。我們注意到96孔板后面的樣品得到稍微更高的密度。更多的研究發(fā)現(xiàn)：隨著時(shí)間增加,，細(xì)胞的平均直徑會(huì)逐漸變大,。

圖4、HELA 細(xì)胞隨時(shí)間增加平均直徑增大的百分比

通過(guò)檢測(cè)得到的細(xì)胞照片發(fā)現(xiàn),，細(xì)胞數(shù)量的增加看上去是膨脹或氣泡,，同時(shí)還伴有許多非細(xì)胞顆粒。雖然通過(guò)細(xì)胞分析參數(shù)設(shè)置,，后者（非細(xì)胞顆粒）通常不會(huì)對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)產(chǎn)生影響,，但它們可能被計(jì)數(shù)為小細(xì)胞。膨脹效應(yīng)導(dǎo)致平均細(xì)胞直徑在3小時(shí)的檢測(cè)時(shí)間內(nèi)增加了差不多10%,，可能導(dǎo)致低于最小直徑閾值的更小的細(xì)胞,，統(tǒng)計(jì)到細(xì)胞計(jì)數(shù)中。

圖5,、從反應(yīng)器中取出時(shí)間> 2 小時(shí)后的細(xì)胞膨脹和氣泡

結(jié)論

通過(guò)96 孔板對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的計(jì)數(shù)和活率分析可以進(jìn)行一些初步的評(píng)估,，包括確定所使用的細(xì)胞在樣品制備方法和長(zhǎng)期暴露于培養(yǎng)箱環(huán)境之外的健壯程度和耐受性,。因?yàn)椋词故窍馛HO細(xì)胞或HELA細(xì)胞這樣的工程細(xì)胞（通常被認(rèn)為是非常強(qiáng)壯的）,，也會(huì)受到壓力或特定樣品制備條件的影響,。