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細胞計數看似簡單,，但有時檢測結果會受到來自樣品的狀態(tài)和儀器的測試條件等影響。在此我們使用Vi-CELL BLU 全自動細胞計數和活率分析儀,，結合96 孔板上樣模式,，通過在單次實驗中使用不同的檢測條件，以此來評估對細胞計數和活率分析的影響,。

待分析細胞

CHO 細胞（中國倉鼠卵巢細胞）,，EL4 細胞（小鼠T 淋巴細胞系），SF9 昆蟲細胞（來自甜菜夜蛾的卵巢組織）和HELA 細胞（人宮頸癌細胞）,。

分析目的

評估較長的分析時間和不同的樣品制備條件對這些細胞計數和活率分析結果的影響,。

分析結果

1CHO細胞樣品制備的影響

細胞接種或做其他實驗之前的細胞換洗和濃縮過程中，離心和重懸是常用的方法,。

一般認為CHO 細胞是比較好生長的,，但有時它們也有特別的生長要求，需要專門的培養(yǎng)基才能達到很好地生長,。以下實驗中,，細胞通過1000g 離心5分鐘（相對溫和的離心）后，在培養(yǎng)基或緩沖液中重懸,，然后評估樣品制備對細胞活率的影響,。

結果顯示：在推薦的培養(yǎng)基中離心和重懸對CHO 細胞沒有明顯的影響。但是,，在PBS 緩沖液中重懸對細胞活率影響較大,，并且平均細胞直徑也明顯下降。同時,，細胞密度也有一些小的減少,，可能是重懸過程中損耗的。在PBS 緩沖液中的第2次離心和重懸對細胞活率和細胞大小也產生了負面影響。

圖1,、 CHO 細胞樣品制備方法的影響

2EL4 細胞混合次數分析

EL4 細胞通常被認為是易碎的,，即使在理想條件下生長也很緩慢，并且活率<70%,。我們制備了EL4 細胞后,，分裝到96 孔板中。細胞類型使用哺乳動物細胞參數,，只是混合次數有差異,。目的是評估增加混合次數后細胞受到混懸和離心破壞的影響有多大。

結果顯示：總細胞計數和密度及細胞直徑都沒有怎么變化,，但活細胞數隨混合次數增加逐漸下降,，因而細胞活率也相應下降。這表明對于這類細胞,，減少樣品吹打混懸和臺盼藍染色混合次數可能會更適合,，過多的吹打混勻需要避免。

圖2,、EL4 細胞混合次數的影響

3SF9 昆蟲細胞延長檢測時間的評估

即使在理想條件下SF9細胞生長要達到高密度也不容易,，通常活率都在60%以下,。

因此通過96孔板上測試使得檢測時間延長,，以此評估可能對細胞產生的負面影響。我們使用了標準昆蟲細胞的參數在96 孔板上對SF9昆蟲細胞進行了檢測,。

結果顯示：在檢測的3個小時過程中,，細胞活率沒有大的影響，細胞直徑也沒有太大變化,，但如果細胞死亡或膨脹,，這兩個參數是會變化的。雖然活率較低,，但在離開細胞培養(yǎng)環(huán)境后比較長時間內并沒有不利影響,，所以這些細胞足夠強壯。

圖3,、 SF9細胞在較長一段時間中表現出的活率和平均直徑

4HELA 細胞直徑隨時間的變化

為了脅迫細胞,，HELA細胞生長成高度融合狀態(tài)，然后收集并重懸分散,。將HELA細胞分裝到96 孔板中,，通過哺乳動物細胞參數測試得到分析結果。96 孔板按每列測試,，從而保證每行之間細胞檢測間隔時間是一致的。我們注意到96孔板后面的樣品得到稍微更高的密度。更多的研究發(fā)現：隨著時間增加,，細胞的平均直徑會逐漸變大,。

圖4、HELA 細胞隨時間增加平均直徑增大的百分比

通過檢測得到的細胞照片發(fā)現,，細胞數量的增加看上去是膨脹或氣泡,，同時還伴有許多非細胞顆粒。雖然通過細胞分析參數設置,，后者（非細胞顆粒）通常不會對細胞計數產生影響,，但它們可能被計數為小細胞。膨脹效應導致平均細胞直徑在3小時的檢測時間內增加了差不多10%,，可能導致低于最小直徑閾值的更小的細胞,，統(tǒng)計到細胞計數中。

圖5,、從反應器中取出時間> 2 小時后的細胞膨脹和氣泡

結論

通過96 孔板對培養(yǎng)細胞的計數和活率分析可以進行一些初步的評估,，包括確定所使用的細胞在樣品制備方法和長期暴露于培養(yǎng)箱環(huán)境之外的健壯程度和耐受性。因為,，即使是像CHO細胞或HELA細胞這樣的工程細胞（通常被認為是非常強壯的）,，也會受到壓力或特定樣品制備條件的影響。