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無(wú)論是在學(xué)術(shù)研究領(lǐng)域還是在生物制藥工業(yè)中,，選擇合適的啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)高效的蛋白生產(chǎn),，在菌種和工藝開(kāi)發(fā)中都起著至關(guān)重要的作用。研究表明甲基營(yíng)養(yǎng)酵母多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha 或 Ogataea polymorpha）和畢赤酵母（Pichia pastoris）是異源基因表達(dá)的有效宿主微生物,，可大規(guī)模生產(chǎn)各種重組蛋白,。它們之所以具有吸引力，還因?yàn)樗鼈兪褂眉状甲鳛槲ㄒ坏奶荚?，需要一套?dú)特的代謝酶,，其生產(chǎn)受到嚴(yán)格控制 ,。[1] 由于其獨(dú)特的特性，漢遜酵母廣泛用作重組蛋白生產(chǎn)的表達(dá)宿主：首先,，相比有些哺乳動(dòng)物的蛋白需要在37°C保持其生物活性,，漢遜酵母菌具有耐熱性，有利于哺乳動(dòng)物蛋白的生產(chǎn),。其次，蛋白質(zhì)糖基化途徑的存在,，使真核重組蛋白生產(chǎn)成為可能,，同時(shí)可以避免過(guò)度糖基化。第三,，其利用甲醇作為碳源的能力允許分離出強(qiáng)甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,。此外，多形漢遜酵母菌還可利用諸如甘油,、葡萄糖,、木糖、纖維二糖等其他碳源,。[2]

多形漢遜酵母菌能在甲醇培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量醇氧化酶和甲醇代謝所需的其他酶,。因此，形成酶的液泡充滿了細(xì)胞的大部分胞內(nèi)空間,。研究人員利用這種獨(dú)特的性質(zhì),，通過(guò)將目的基因連接至醇氧化酶基因?qū)崿F(xiàn)外源蛋白表達(dá)。[3] 將外源基因連接至醇氧化酶基因的啟動(dòng)子,，可獲得高水平重組蛋白,。[1] 形漢遜酵母菌在理想培養(yǎng)條件下，使用甲酸脫氫酶（FMD）或甲醇氧化酶（MOX）等強(qiáng)啟動(dòng)子可獲得超高蛋白滴度,。甲基營(yíng)養(yǎng)酵母的強(qiáng)分泌能力與成熟的高細(xì)胞密度發(fā)酵技術(shù)相結(jié)合,，可使外源蛋白分泌量高達(dá)每升數(shù)克。[4] 這兩種啟動(dòng)子均被葡萄糖或乙醇強(qiáng)烈抑制,，而被甲醇作為唯一碳源高度誘導(dǎo),。如果甘油或葡萄糖的補(bǔ)料低于細(xì)胞生長(zhǎng)限制速率，則MOX啟動(dòng)子不受抑制,。[1]

在本應(yīng)用中,，我們使用微型生物反應(yīng)器BioLector探索漢遜酵母獲得高產(chǎn)量的綠色熒光蛋白（GFP）所需的PH條件。在本高通量發(fā)酵研究中,，我們研究含有 FMD 和 MOX 啟動(dòng)子的多形漢遜酵母菌種,，以確定高效蛋白生產(chǎn)所需的首選 pH 范圍。截至目前,，研究表明在小規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)中低 pH 范圍 4-6 非常難以測(cè)定和控制,。這里,，光學(xué) pH 傳感器是首選的測(cè)量系統(tǒng)。使用普通的傳感器往往只能在生理 pH 范圍內(nèi)提供可靠的結(jié)果,。在本研究中,，我們將近期發(fā)布的低pH傳感器集成至 BioLector中，以便進(jìn)行可靠的非侵入式pH 篩選,，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程 pH 控制,，提高蛋白生產(chǎn)效率。pH通過(guò)微孔板（MTP）中的微流控芯片控制,，并在紅外光譜范圍進(jìn)行光學(xué)測(cè)量,，以減少培養(yǎng)基中背景熒光的干擾。這使得BioLector高通量微型發(fā)酵平臺(tái)可在低 pH 條件下使用熒光報(bào)告基因（如 GFP）跟蹤整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的蛋白表達(dá),。

方法

菌株

多形漢遜酵母RB11 MOX-GFP 菌株和 RB11 FMD-GFP 菌株

培養(yǎng)基

葡萄糖為碳源的無(wú)氨基酸酵母氮源培養(yǎng)基中（YNB-D）培養(yǎng)：含有1.34g/L 酵母氮源,、5g/L (NH4)2SO4和20g/L葡萄糖。此外,，使用不同濃度（100mM,、50mM 和 25mM）的磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）

培養(yǎng)條件

在BioLector中采用微流控梅花板進(jìn)行培養(yǎng)。振搖速度1200rpm,，溫度為 30°C,。每孔培養(yǎng)體積 800μL。以 3M NaOH和3M HCl作為pH調(diào)節(jié)劑,，通過(guò)微流控芯片在pH 4 –6范圍內(nèi)雙向調(diào)節(jié)pH,。

在線測(cè)量參數(shù)

生物量、GFP,、pH和溶氧

結(jié)果

在不同緩沖液濃度的YNB-G培養(yǎng)基中進(jìn)行分批培養(yǎng)：通過(guò)預(yù)篩選實(shí)驗(yàn)研究GFP對(duì)培養(yǎng)基中磷酸鹽緩沖液濃度和未調(diào)節(jié)pH值的依賴趨勢(shì),。為此，在YNB-D中將漢遜酵母菌RB11 FMD-GFP 菌株進(jìn)行分批培養(yǎng),，磷酸鹽緩沖液濃度調(diào)節(jié)為25mM,、50mM 或 100mM。GFP產(chǎn)量,、pH值與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系如圖1所示,。只要培養(yǎng)基中含有葡萄糖，F(xiàn)MD啟動(dòng)子就會(huì)受到抑制,，因此當(dāng)葡萄糖含量低或被完全消耗時(shí),，就會(huì)誘導(dǎo)GFP表達(dá)。正如預(yù)期,，培養(yǎng)基緩沖液濃度越低,，pH值下降越快。相比，低緩沖液濃度培養(yǎng)基中GFP產(chǎn)生的時(shí)間比高緩沖液濃度培養(yǎng)基更早,。一個(gè)原因可能是低緩沖液濃度培養(yǎng)基滲透壓更低,，培養(yǎng)條件更好，從而獲得更高的GFP產(chǎn)量,。另一個(gè)原因可能是因?yàn)榈途彌_液濃度培養(yǎng)基的pH值下降更快,，而這種低pH的環(huán)境在代謝生產(chǎn)力方面是更好的。

進(jìn)行pH分析以尋求GFP高效表達(dá)的最佳條件：在接下來(lái)的多形漢遜酵母菌RB11 FMD-GFP菌株分批培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,，使用緩沖液濃度為25mM的培養(yǎng)基,，并在培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)BioLector的微流控芯片技術(shù)調(diào)控pH值。我們分析了pH在4.0- 6.5范圍的GFP 表達(dá)性能,。圖 2顯示三組培養(yǎng)實(shí)例中GFP合成和pH控制情況,。從初步分批培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中可以看出，pH設(shè)定值越低,，GFP開(kāi)始表達(dá)的時(shí)間就越早。此外,，pH設(shè)定值越低,，GFP信號(hào)的斜率越陡。請(qǐng)注意,，在這里GFP只是目的蛋白質(zhì)的替代物,，由于GFP在較低pH范圍內(nèi)不穩(wěn)定[5]，GFP在pH為4時(shí)的降解速度比在較高pH值時(shí)要快得多,，因此這里只能作定性比較,。

仔細(xì)觀察最大GFP信號(hào)（圖 3）以及隨后計(jì)算GFP表達(dá)的時(shí)空產(chǎn)率（圖 4），每一項(xiàng)根據(jù)調(diào)整的PH設(shè)定值繪制,，證實(shí)了GFP在較低PH條件下表達(dá)較高的假設(shè),。盡管PH值為6時(shí)獲得最強(qiáng)GFP 信號(hào)（359.35 a.u.），但GFP表達(dá)的時(shí)空產(chǎn)率（STY）仍呈現(xiàn)隨PH增大而降低的趨勢(shì),。pH為4.0時(shí)獲得最高STY 10.24 I/mL*h,。請(qǐng)注意，GFP 只是目的蛋白質(zhì)的替代物,，由于GFP在較低PH范圍內(nèi)不穩(wěn)定[5],，GFP 在PH為4時(shí)的降解速度比在較高PH值時(shí)要快得多。

評(píng)估不同啟動(dòng)子：對(duì)多形漢遜酵母RB11 FMD-GFP菌株和RB11 MOX-GFP菌的培養(yǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,，評(píng)估pH設(shè)定值固定為4.5的情況下GFP表達(dá)所用FMD和MOX 啟動(dòng)子的特性,。圖5為兩種株菌生物量和DO信號(hào)以及pH、GFP值與培養(yǎng)時(shí)間關(guān)系的曲線圖,。從生物量和DO曲線上可看出,，兩種菌株具有相似的生長(zhǎng)行為。但是，GFP信號(hào)可以發(fā)現(xiàn),，多形漢遜酵母菌RB11 FMD-GFP菌株的GFP信號(hào)高出7倍,。

結(jié)論

采用BioLector進(jìn)行生物量、GFP,、pH 和 DO 的非侵入式在線測(cè)量,，可成功篩選出多形漢遜酵母蛋白表達(dá)的 pH 和菌株。本研究發(fā)現(xiàn),，較低pH 值和FMD 啟動(dòng)子有利于 GFP 的表達(dá)（GFP 代表目標(biāo)蛋白質(zhì)）,。此外，基于BioLector的微流控技術(shù),，可在一塊微孔板上同時(shí)進(jìn)行多達(dá)32個(gè)不同條件的平行發(fā)酵以篩選漢遜酵母生產(chǎn)重組蛋白的最佳培養(yǎng)條件,。

參考文獻(xiàn)[1] Raschke, W., Neiditch, B., et al. (1996) Inducible expression of a heterologous protein in Hansenula polymorpha using the alcohol oxidase 1 promoter of Pichia pastoris. Elsevier Science Gene 177, 163-167. [2] Manfr?o-Netto, J., Gomes, A. and Parachin, N. (2019) Advances in Using Hansenula polymorpha as Chassis for Recombinant Protein Production. Front. Bioeng. Biotechnol. 7:94. doi: 10.3389/fbioe.2019.00094 [3] Kurtzman, C. & Robnett, C. (2010) Systematics of methanol assimilating yeasts and neighboring taxa from multigene sequence analysis and the proposal of Peterozyma gen.nov., a new membe rof the Saccharomycetales. FEMS Yeast Res 10, 353–361. [4] Hartner, F. & Glieder, A. (2006) Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts. Microbial Cell Factories, 5:39. doi:10.1186/1475-2859-5-3 [5] Campbell, T. & Choy, F. (2001) The Effect of pH on Green Fluorescent Protein: A Brief Review, Molecular Biology Today 2 (1), 1-4.