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盡管不少同學(xué)與老師認(rèn)為光譜流式無(wú)需像傳統(tǒng)流式那樣調(diào)節(jié)補(bǔ)償,，甚至可以使用光譜接近的熒光染料,，從而在流式多色方案設(shè)計(jì)上可以隨意搭配，然而,，在實(shí)際嘗試光譜流式細(xì)胞儀后,，這種誤解常常導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想。即使在光譜流式中,，熒光染料的選擇和搭配仍然需要經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)和優(yōu)化,，以避免信號(hào)干擾和數(shù)據(jù)解讀錯(cuò)誤。因此,，合理設(shè)計(jì)多色實(shí)驗(yàn)仍然是獲得準(zhǔn)確可靠結(jié)果的關(guān)鍵所在,。

圖1：補(bǔ)償?shù)亩x：(a) 顯示了使用PE標(biāo)記抗體染色的人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）未經(jīng)補(bǔ)償（左圖）和補(bǔ)償后（右圖）的數(shù)據(jù),。為了去除630/30濾光片中的PE信號(hào)，需要計(jì)算Y/X*100的比例,。補(bǔ)償后的數(shù)據(jù)展示了PE信號(hào)的擴(kuò)散（spread）。(b) PE的發(fā)射譜圖中展示了在(a)圖中使用的兩個(gè)濾光片。

無(wú)論采用哪種技術(shù),，免疫分型實(shí)驗(yàn)的成功都取決于對(duì)Spillover和Spread的正確理解和管理。這些概念對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精準(zhǔn)性至關(guān)重要,。無(wú)論使用傳統(tǒng)流式還是光譜流式,，精心設(shè)計(jì)和優(yōu)化熒光染料組合,，合理應(yīng)對(duì)這些關(guān)鍵挑戰(zhàn),，仍然是獲得可靠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的關(guān)鍵步驟。

首先,，讓我們通過(guò)一個(gè)具體案例來(lái)深入理解Spread如何影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

圖2：擴(kuò)散（spread）現(xiàn)象的重要性：人類外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）被標(biāo)記了Alexa Fluor 647標(biāo)記的CD45RA，以及BV421,、PE-CF594或PE-Cy5標(biāo)記的CD4抗體,。藍(lán)色輪廓表示單色CD4染色細(xì)胞,，紅色輪廓顯示了組合染色,。圖中顯示雙陽(yáng)性群體在低擴(kuò)散（spread）情況下能更好地與單陽(yáng)性群體分離，尤其是來(lái)自僅染色CD4的細(xì)胞,，這通過(guò)更高百分比得以顯示,。這說(shuō)明擴(kuò)散（spread）在數(shù)據(jù)分析中的重要性,。

每種熒光染料的光譜都有可能部分重疊，即使在解混（unmix）過(guò)程中也難以完全避免這種干擾,。如果不慎重選擇熒光染料組合，特別是光譜接近的染料,，可能會(huì)導(dǎo)致解混（unmix）后信號(hào)分離不完全，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性,。因此,，無(wú)論使用的是傳統(tǒng)流式還是光譜流式，精心設(shè)計(jì)和優(yōu)化多色免疫分型方案,，合理選擇熒光染料組合,，仍然是獲得可靠實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵步驟。

圖3：spread如何減弱信號(hào)的分離效果：在第一行（配色方案1），我們選擇了不會(huì)在APC和PerCP-eFluor 710檢測(cè)器中引起spread的熒光染料,。盡管在CD4軸上有輕微但明顯的分離（黑色箭頭所示），TCRγδ單陽(yáng)性和TCRγδ/CD3雙陽(yáng)性信號(hào)（紅色箭頭所示）的分離效果也相對(duì)良好,。在第二行（配色方案2），我們使用了BV650（結(jié)合CD45）,，引入了APC檢測(cè)器中的spread，并消除了配色方案1中看到的分離（黑色箭頭）,。此外,，將結(jié)合CD3的熒光染料從BV605改為APC-R700后,，在PerCP-eFluor 710檢測(cè)器中引起了spread，導(dǎo)致了TCRγδ信號(hào)分離度變差（紅色箭頭）,。

接下來(lái)我們進(jìn)一步明確兩者的概念：

Spillover（溢出）：

當(dāng)熒光分子吸收光子時(shí)，會(huì)使電子躍遷至更高能級(jí),，隨后釋放出能量較低（波長(zhǎng)較長(zhǎng)）的光子。該光子在可見(jiàn)光譜范圍內(nèi),。流式細(xì)胞儀不僅測(cè)量主檢測(cè)器中的熒光信號(hào)，還會(huì)在一個(gè)或多個(gè)次級(jí)檢測(cè)器中檢測(cè)到信號(hào),，這種現(xiàn)象被稱為“Spillover（溢出）”。

Spread（擴(kuò)散）：

Spillover（溢出）造成了真實(shí)信號(hào)識(shí)別的困難（光譜的重疊）。為了解決這個(gè)問(wèn)題,，傳統(tǒng)流式使用補(bǔ)償技術(shù)（compensation）,，光譜流式使用解混（unmix）技術(shù)。然而,，在溢出效應(yīng)時(shí)，數(shù)據(jù)的信號(hào)方差增加,，會(huì)影響信號(hào)的區(qū)分和檢測(cè)靈敏度,。

為了更好地評(píng)估Spillover和Spread對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，我們需要使用一些專門的工具來(lái)對(duì)這兩個(gè)現(xiàn)象進(jìn)行量化分析,。這些工具能夠幫助我們深入探討不同熒光染料在檢測(cè)器中的行為,，量化其對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的潛在影響。通過(guò)使用這些工具,，我們不僅可以更準(zhǔn)確地設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),，還能確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和精確性,。接下來(lái),，我們將詳細(xì)介紹兩個(gè)在量化這些現(xiàn)象時(shí)非常有用的工具，它們將在流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,。

Spillover Spreading Matrix, SSM

（溢出擴(kuò)散矩陣）

SSM 是一種定量工具,，用于衡量每個(gè)熒光染料的信號(hào)在不同檢測(cè)器中的擴(kuò)散（spread）,。它提供了各熒光染料之間相互影響的完整矩陣信息,，幫助識(shí)別可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確的信號(hào)重疊,。

Spread Quantification Index, SQI

（擴(kuò)散量化指數(shù)）

SQI 是一個(gè)獨(dú)立于熒光染料濃度和檢測(cè)器類型的標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù),，并且通過(guò)歸一化，SQI值獨(dú)立于檢測(cè)器的電壓/增益設(shè)置,，使其在不同儀器和實(shí)驗(yàn)條件下具有可比性,。作為評(píng)估熒光染料在多色流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的spread程度的工具，有助于優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),，減少數(shù)據(jù)誤差,，提高結(jié)果的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

圖4：SSM（溢出擴(kuò)散（spread）矩陣） 和 SQI（擴(kuò)散（spread）量化指數(shù)） 的概念與計(jì)算： (a)左圖部分,，首先計(jì)算Y軸上陽(yáng)性和空白微球的標(biāo)準(zhǔn)差四分位數(shù),，并進(jìn)行減法操作。此結(jié)果通過(guò)X軸上陽(yáng)性和空白微球的中位數(shù)差進(jìn)行歸一化,。所得結(jié)果為Intrinsic Spillover Spread (ISS),，這些數(shù)值顯示在溢出擴(kuò)散（spread）矩陣中。 (b)右圖部分,， 主要熒光染料X（在檢測(cè)器A）向檢測(cè)器B的溢出熒光導(dǎo)致了Y軸上的擴(kuò)散（spread）,。擴(kuò)散（spread）的量化是Y軸上99百分位數(shù)和50百分位數(shù)之間的差異,，并乘以歸一化因子，使得SQI值獨(dú)立于檢測(cè)器增益設(shè)置,。綠色線表示99百分位數(shù)的位置,。

兩個(gè)工具的的主要差異可以總結(jié)為下表：

在光譜流式的配色設(shè)計(jì)中，由于并不同于傳統(tǒng)流式,，熒光素對(duì)應(yīng)某個(gè)熒光檢測(cè)通道,，每個(gè)檢測(cè)通道都會(huì)收集所有熒光染料的信號(hào)，再通過(guò)光譜解混（unmix）來(lái)分離重疊的光譜,，因此需要額外的工具來(lái)優(yōu)化配色方案,。

Complexity Index（復(fù)雜性指數(shù)）

用于評(píng)估信號(hào)混雜和解混（unmix）的復(fù)雜程度，幫助選擇較優(yōu)的熒光組合,，以減少?gòu)?fù)雜性,，確保多色實(shí)驗(yàn)的有效性。

Similarity Matrix（相似性矩陣）

用于衡量熒光染料之間的光譜重疊程度,，避免選用光譜過(guò)于接近的染料組合,，從而減少解混（unmix）誤差，提高實(shí)驗(yàn)精度,。

圖5：FluoroFinder 根據(jù)光譜流式細(xì)胞儀的配置和所選熒光染料生成參考Similarity Matrix（相似性矩陣） 和參考 Complexity Index（復(fù)雜性指數(shù)）,。這些工具幫助用戶評(píng)估熒光染料之間的光譜重疊程度，并評(píng)估信號(hào)混雜和解混（unmix）的復(fù)雜性,。通過(guò)使用這些指標(biāo),，研究人員可以優(yōu)化多色配色方案，選擇最佳熒光組合,，減少解混（unmix）誤差,，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。在同型號(hào)的不同配置儀器,，對(duì)于同樣的熒光素組合,，其參考矩陣不同，且參考Complexity Index（復(fù)雜性指數(shù)）也不同,。

通過(guò)精準(zhǔn)掌握Spillover和Spread的概念,，以及巧妙運(yùn)用SSM、SQI,、Complexity Index和Similarity Matrix等工具,，您不僅能在傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)中應(yīng)對(duì)復(fù)雜的多色實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，還能在光譜流式中游刃有余,。這樣,，您的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)將更加可靠和高效。

CytoFLEX 系列流式細(xì)胞儀憑借其創(chuàng)新的雪崩光電二極管（APD）檢測(cè)器和卓越的光學(xué)設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了更低的SQI（Spread Quantification Index）,。APD 檢測(cè)器具有更高的靈敏度和更低的噪聲水平，能夠更精確地捕捉微弱的熒光信號(hào),。這種設(shè)計(jì)減少了信號(hào)擴(kuò)散（spread）和溢出效應(yīng),，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定和精確。卓越的光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)一步優(yōu)化了信號(hào)檢測(cè)路徑,，確保了數(shù)據(jù)的高質(zhì)量和可重復(fù)性,，是多色流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的理想選擇。

圖6：四種不同流式細(xì)胞儀中比較spread現(xiàn)象,；使用不同的單染色微球集群在四種不同儀器上運(yùn)行,。對(duì)每種組合計(jì)算了SQI值。SQI值按以下范圍分類：1-120（綠色）,；121-199（黃色）,；200-299（橙色）；和300以上（紅色）,。

CytoFLEX流式細(xì)胞儀的補(bǔ)償庫(kù)設(shè)計(jì)極大地提升了多色實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和效率,。通過(guò)預(yù)先建立和存儲(chǔ)多種熒光染料組合的補(bǔ)償設(shè)置，研究人員能夠快速應(yīng)用適合的補(bǔ)償參數(shù),，減少手動(dòng)調(diào)整的時(shí)間和誤差,。這不僅簡(jiǎn)化了復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程，還確保了在多色分析中獲得一致且可靠的結(jié)果,，從而使得實(shí)驗(yàn)更加精確和高效,。

圖7：CytoFLEX流式細(xì)胞儀在多色實(shí)驗(yàn)中的補(bǔ)償調(diào)節(jié)工作流程。CytoFLEX通過(guò)其先進(jìn)的補(bǔ)償庫(kù)設(shè)計(jì),，使實(shí)驗(yàn)過(guò)程更加高效和精準(zhǔn),。用戶僅需設(shè)定通道電壓或增益并收集單染管數(shù)據(jù)，系統(tǒng)便會(huì)自動(dòng)計(jì)算補(bǔ)償矩陣,。在獲得補(bǔ)償庫(kù)后,，若需要調(diào)整，CytoFLEX能夠智能調(diào)整增益和電壓,，重新計(jì)算補(bǔ)償,，無(wú)需重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟。相比傳統(tǒng)方法,，CytoFLEX的這一創(chuàng)新設(shè)計(jì)減少了實(shí)驗(yàn)誤差,，大幅提升了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和效率，為研究人員提供了更強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)支持,。

在科學(xué)研究中,，概念與方法是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基石，而先進(jìn)的技術(shù)則是實(shí)現(xiàn)這一切的驅(qū)動(dòng)力。CytoFLEX流式細(xì)胞儀以其卓越的光學(xué)設(shè)計(jì)和智能化的補(bǔ)償庫(kù),，為多色實(shí)驗(yàn)帶來(lái)了前所未有的精確性和效率,。科技不僅是工具,，更是未來(lái)的指引者,，推動(dòng)著我們?cè)谔剿魑粗牡缆飞喜粩嗲靶小Ｗ尲夹g(shù)與科學(xué)相結(jié)合,，共同演繹出未來(lái)的無(wú)限可能,。 

● 文章來(lái)源：

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