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細(xì)胞系在某些培養(yǎng)條件下可能形成弱聚集的團(tuán)聚體和更難分離的聚集體,，譬如人胚胎腎細(xì)胞（HEK）（1）,。通過軟件算法準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)團(tuán)聚體和聚集體中的細(xì)胞數(shù)會(huì)有困難，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確,。為了減輕這種情況,，在取樣進(jìn)行分析之前，可能需要優(yōu)化樣品制備方法,，以消除或減少較大的團(tuán)聚體和聚集體（2）,。Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀集成了軟件功能，可以更準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行計(jì)數(shù),，在我們上一篇“團(tuán)聚細(xì)胞計(jì)數(shù)的應(yīng)用解決方案：Cell Type參數(shù)優(yōu)化”應(yīng)用短文中有更詳細(xì)的描述,。
如果軟件不能有效識(shí)別和統(tǒng)計(jì)團(tuán)聚體和聚集體中的細(xì)胞數(shù)量，Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀軟件將統(tǒng)計(jì)這些較大的細(xì)胞簇,，并在圖像中用紅色方塊標(biāo)記它們（下圖3）,。由于軟件對(duì)大型（有時(shí)是三維）細(xì)胞簇的細(xì)胞計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確，所以其中的細(xì)胞沒有統(tǒng)計(jì),。但是,，軟件會(huì)統(tǒng)計(jì)并報(bào)告這些較大的細(xì)胞簇?cái)?shù)量。通過查看細(xì)胞簇的數(shù)量,，您可以檢查特定樣本的聚集程度,。由于大聚集體可能對(duì)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響，原因包括代謝擴(kuò)散減少導(dǎo)致細(xì)胞生長不良,，以及質(zhì)粒和病毒顆粒無法到達(dá)內(nèi)部細(xì)胞,，引起轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率下降從而導(dǎo)致滴度降低（3），因此這種情況最好停止培養(yǎng),。如果檢測(cè)確定細(xì)胞簇不可接受,，但仍需要計(jì)數(shù)，則可能需要建立新的樣品制備過程,。
對(duì)于在某些條件下難以分離聚集體的細(xì)胞系,，如一些HEK293細(xì)胞培養(yǎng)，需要額外的團(tuán)聚分離優(yōu)化策略,，即得到分離良好的細(xì)胞懸液由Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀檢測(cè),，從而實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù),。在本應(yīng)用短文中，我們描述了不同的分離介質(zhì)和移液吹打?qū)N壁HEK293細(xì)胞的聚集程度,、存活率和活細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響。我們還提供了一種側(cè)樣制備技術(shù),，可以在Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀上獲得更準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)結(jié)果,，而無需改變傳代培養(yǎng)細(xì)胞的現(xiàn)有分離方法。
在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中,，測(cè)試了3種酶分離介質(zhì)：胰蛋白酶,、含EDTA的胰蛋白酶和TrypLE。此外,，用1000μL移液槍上下吹打,，在單個(gè)樣品上測(cè)試每種分離介質(zhì)。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中,，在初始胰蛋白酶處理后采集側(cè)樣本,，并用TrypLE處理。
分離介質(zhì)優(yōu)化過程
1,、HEK293細(xì)胞在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中生長,，在含有10%FBS的DMEM中融合率>70%。
分別準(zhǔn)備兩個(gè)培養(yǎng)瓶,，用于測(cè)試胰蛋白酶,、TrypLE和胰蛋白酶-EDTA作為分離處理
2、移除培養(yǎng)基,，用5mL新鮮的無Ca2+,、Mg2+離子的DPBS沖洗單層細(xì)胞。
3,、加入2mL分離介質(zhì),，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶以確保單層細(xì)胞完全被覆蓋。培養(yǎng)細(xì)胞在37°C和5% CO2下孵育2分鐘,。
注意：輕輕搖晃細(xì)胞上的培養(yǎng)基可以確保單層細(xì)胞完全被分離分離介質(zhì)覆蓋,，但是，敲擊或搖晃培養(yǎng)瓶太劇烈可能會(huì)導(dǎo)致大簇細(xì)胞立即被移除,。
4,、孵育2分鐘后，細(xì)胞完全從培養(yǎng)瓶中分離出來,，加入10毫升含有10%FBS的溫?zé)酓MEM,，用10mL移液槍上下吹打5次，輕輕混合,。
5,、接下來將3mL培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到四個(gè)5mL試管中,，將12mL培養(yǎng)細(xì)胞分開。
兩個(gè)試管被指定為未吹打?qū)φ?，兩個(gè)被指定為吹打后的樣品,。
-對(duì)于吹打好的樣品，用1000μL移液槍上下吹打1000μL懸浮液10次,。
6,、將試管輕輕翻轉(zhuǎn)3次進(jìn)行混勻，將5個(gè)200μL的重復(fù)樣本分配到Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀樣品管中,，并在Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀上測(cè)試結(jié)果,。
通過在樣品管和重復(fù)樣本之間交替分析吹打后樣品和未吹打?qū)φ掌返慕Y(jié)果。譬如,，吹打管1-重復(fù)1,，未吹打管1-重復(fù)1，吹打管2-重復(fù)1,，未吹打管2-重復(fù)1,。
7、通過使用Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀上默認(rèn)設(shè)置和Mammalian細(xì)胞類型分析樣品,。
8,、對(duì)于每種分離介質(zhì)，兩個(gè)培養(yǎng)瓶中的樣品檢測(cè)重復(fù)該流程,。
表1. 試劑清單
分離介質(zhì)優(yōu)化結(jié)果
與胰蛋白酶處理的樣品相比,，胰蛋白酶-EDTA和TrypLE處理的樣品的平均細(xì)胞簇?cái)?shù)量顯著降低（p<0.05；Student's t-檢驗(yàn)）,，表明使用胰蛋白酶-EDTA和TrypLE進(jìn)行了更有效的細(xì)胞分離,。胰蛋白酶-EDTA和TrypLE處理的樣品細(xì)胞簇?cái)?shù)量相似，表明兩種分離介質(zhì)的性能相似,。胰蛋白酶-EDTA和TrypLE處理的樣品,，吹打能夠顯著降低細(xì)胞簇?cái)?shù)量（p<0.05；Student’s t-檢驗(yàn)）,，表明通過移液槍吹打得到更弱的細(xì)胞簇,，然而，吹打不能分離胰蛋白酶處理樣品中的聚集體,。胰蛋白酶-EDTA和TrypLE的活細(xì)胞密度相似,，組間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05；Student's t-檢驗(yàn)）,。在所有情況下,，移液槍吹打都提高了存活率，這可能是由于在沒有團(tuán)聚體和聚集體的情況下采用了更有效的計(jì)數(shù)算法。
圖1: 三種分離介質(zhì)和吹打得到的平均細(xì)胞簇?cái)?shù)量,，平均活細(xì)胞密度和平均活率結(jié)果,。結(jié)果是每組所有試管和培養(yǎng)瓶的所有重復(fù)的平均值。使用JMP 16.1.0版對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,。
側(cè)樣品分離方法
1,、HEK293細(xì)胞在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中生長，在含有10%FBS的DMEM中融合率>70%,。
準(zhǔn)備3個(gè)培養(yǎng)瓶來測(cè)試側(cè)樣品分離方法,。
2、移除培養(yǎng)基,，用5mL新鮮的無Ca2+、Mg2+離子的DPBS沖洗單層細(xì)胞,。
3,、然后，加入2mL胰酶介質(zhì),，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶以確保單層細(xì)胞完全被覆蓋,。培養(yǎng)細(xì)胞在37°C和5% CO2下孵育2分鐘。
4,、孵育2分鐘后,，加入10 mL含有10%FBS溫?zé)岬腄MEM，用10mL移液槍上下吹打5次,，輕輕混合,。
5、接下來將3mL培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到四個(gè)5mL試管中,，將12mL培養(yǎng)細(xì)胞分開,。
兩個(gè)試管被指定為對(duì)照，另外兩個(gè)被指定為側(cè)樣品,。
將兩個(gè)對(duì)照管翻轉(zhuǎn)3次,，從每個(gè)管中取出3個(gè)200μL的樣品，并在Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀上測(cè)試結(jié)果,。它們被指定為未經(jīng)處理的對(duì)照組,，代表了現(xiàn)有的傳代流程。剩余體積被指定為處理后的對(duì)照,。
將兩個(gè)側(cè)樣品管翻轉(zhuǎn)3次,，然后將所有4個(gè)管（兩個(gè)2400μL對(duì)照管和兩個(gè)3000μL側(cè)樣品管）在500 rcf下離心3分鐘使細(xì)胞沉淀。
6,、離心后取出培養(yǎng)基,，將細(xì)胞重新懸浮在400μL含10%FBS的DMEM（用于2個(gè)處理過的對(duì)照管）或500μL TrypLE（用于2側(cè)樣品管）中，然后用1000μL移液槍上下吹打10次以重新懸浮細(xì)胞。
7,、在室溫下孵育2分鐘后,，將樣品重新懸浮至初始體積（處理過的對(duì)照為2400μL，側(cè)面樣品為3000μL）,。
8,、用1000μL移液槍上下吹打樣品10次混合，然后將試管翻轉(zhuǎn)3次,。
9,、接下來，從每根試管中取五個(gè)200μL的重復(fù)樣本,，在Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀上測(cè)試,，在處理過的對(duì)照試管和側(cè)樣本試管之間以及重復(fù)樣本之間交替測(cè)試，每種情況共測(cè)試10次,。例如,，處理過的對(duì)照管1-重復(fù)1，側(cè)樣品管1-重復(fù)1,，處理過的對(duì)照管2-重復(fù)1,，側(cè)樣品管2-重復(fù)1。
10,、使用默認(rèn)設(shè)置和Mammalian細(xì)胞類型分析所有樣本,。對(duì)總共3個(gè)培養(yǎng)瓶重復(fù)該流程。
側(cè)樣品分析結(jié)果
TrypLE處理的側(cè)樣本的細(xì)胞簇?cái)?shù)量明顯低于未處理和處理的對(duì)照組（p<0.05,；Student's t-檢驗(yàn)）,。經(jīng)過額外處理步驟的胰蛋白酶處理的對(duì)照組和經(jīng)TrypLE處理的樣本，VCD明顯高于未經(jīng)處理的對(duì)照組（p<0.05,；Student’s t-檢驗(yàn)）,。處理過的對(duì)照組較高的VCD可能是由于額外的混合和移液步驟導(dǎo)致團(tuán)聚體分離開。額外的處理顯著降低了處理后對(duì)照組相比未處理對(duì)照組的存活率,，略微降低了1.5%（p<0.05,；Student's t-檢驗(yàn)）。與未處理和處理的對(duì)照組相比,，TrypLE處理顯著提高了存活率（p<0.05,；Student's t-檢驗(yàn)），這可能是因?yàn)樵跊]有團(tuán)聚體的情況下計(jì)數(shù)更準(zhǔn)確,。
圖2: TrypLE處理后側(cè)樣品,，未處理對(duì)照和介質(zhì)處理后的對(duì)照。它們的平均細(xì)胞簇?cái)?shù)量,，平均活細(xì)胞密度和平均活率結(jié)果,。結(jié)果是每組所有試管和培養(yǎng)瓶的所有重復(fù)的平均值,。使用JMP 16.1.0版對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
對(duì)圖像的回顧顯示了胰蛋白酶處理樣本存在大的紅色框標(biāo)記和一些較小的細(xì)胞團(tuán)聚體（圖3左圖）,。TrypLE處理的側(cè)樣本（圖3右圖）顯示了很少的細(xì)胞簇和較少的細(xì)胞團(tuán)聚體,。
圖3: 胰酶對(duì)照組（左）和TrypLE處理后的側(cè)樣品（右）的圖像示例
討論
如前所述，分離方法的選擇會(huì)顯著影響存活率,、活細(xì)胞計(jì)數(shù)和聚集程度,。通過移液槍進(jìn)行溫和地吹打可能會(huì)分離弱聚集的團(tuán)聚體，并且允許在不降低細(xì)胞活率的情況下進(jìn)行更準(zhǔn)確的計(jì)數(shù),。對(duì)于更大,、更難分離且對(duì)移液槍吹打反應(yīng)不佳的細(xì)胞簇，用替代的分離介質(zhì),，譬如胰蛋白酶加EDTA或TrypLE,，可以使細(xì)胞懸浮液更加分離。
最后,，若繼續(xù)使用現(xiàn)有的分離方法,，也可以選擇使用側(cè)樣技術(shù)，從而在Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀上實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的計(jì)數(shù),。
● 參考文獻(xiàn)：
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4. Drummen, N. Cell Type settings considerations for counting clumpy cells on the Vi-CELL BLU cell viability analyzer. Beckman Coulter application note. Content ID: 2023-GBL-EN-101699
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