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貝克曼庫爾特 | 高通量篩選大腸桿菌重組蛋白生產(chǎn)用酵母營養(yǎng)素

貝克曼庫爾特生命科學 2022-06-14 | 閱讀：1967

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隨著重組DNA技術的迅猛發(fā)展,，外源基因在不同宿主中的表達使得各種重組蛋白的工業(yè)生物生產(chǎn)成為可能,。選擇合適的宿主是生物工藝設計中的關鍵步驟之一，具體取決于：

1.上游培養(yǎng)效率

2.易于基因編輯和分子工具的可用性

3.翻譯后修飾的能力,，如糖基化

4.蛋白質(zhì)（用于下游加工和作為生物制藥成分等）的分泌能力

目前,，多種生物已被應用于重組蛋白的生產(chǎn)，尤其是大腸桿菌,，易于基因改造,，具有在酵母水解物等多種基質(zhì)上快速生長并產(chǎn)生高蛋白滴度的優(yōu)勢。已成為迄今為止業(yè)界追捧的主力軍,。

典型的生物工藝優(yōu)化通常需要進行一些初步試驗,，以發(fā)現(xiàn)適用于宿主菌株并提高目的重組蛋白表達的培養(yǎng)基成分（特別是氮基營養(yǎng)素）,。對于此類應用需求，能夠提高實驗效率和參數(shù)準確度的高通量篩選平臺成為熱門工具,。貝克曼庫爾特BioLector通過在線測量關鍵培養(yǎng)參數(shù)提供可放大的高通量分析,。

本案例為通過BioLector對多種酵母營養(yǎng)素就生物量生長和重組蛋白的形成進行評估和比較，篩選出了適合大腸桿菌重組蛋白生產(chǎn)和誘導時間的理想培養(yǎng)基,。

方法

培養(yǎng)菌株：大腸桿菌BL21(DE3)pET-28a(+)EcFbFP,。

培養(yǎng)基：以標準TB培養(yǎng)基（Carl Roth）為參照物，對多個TB 樣（Terrific 液）培養(yǎng)基進行比較,。不同的TB 樣培養(yǎng)基使用不同的酵母提取物。

BioLector培養(yǎng)條件：在接種至微孔板之前,，先在250 mL搖瓶中進行預培養(yǎng),， 37°C培養(yǎng)6小時。然后使用48孔梅花板（MTP-BOH2）在 BioLector中進行培養(yǎng),。溫度 37°C ,，振搖速度：1400 rpm。分別在每個培養(yǎng)孔中填充800μL培養(yǎng)液用于非誘導實驗,，填充790μL用于誘導實驗,。誘導實驗中，在誘導時間點上添加 10μL 50μM 的 IPTG,。環(huán)境氧氣濃度保持在35%,，避免培養(yǎng)物缺氧。

BioLector在線測量：培養(yǎng)過程中對生物量,、EcFbFP(黃素熒光蛋白),、pH以及 DO進行在線測量。

結果

不同TB樣培養(yǎng)基的生物量生長情況：

3.1.png

培養(yǎng)實驗中,，不同酵母營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中生物量的生長情況如上圖所示：培養(yǎng)基不同,，最終的光密度和生長速率也會不同。ProCel 6 中的大腸桿菌OD最高,，培養(yǎng)基 ProCel 3 中的大腸桿菌的OD低,。ProCel 6為本特定工藝的最高生長速率。

3.2.png

上圖為培養(yǎng)過程的DO值,。培養(yǎng)基 ProCel 3 和 ProCel 4 中的培養(yǎng)物未達到0%的氧飽和度,，這表明由于耗氧量有限，該培養(yǎng)基中的菌株代謝活性較低,。相反,，其他培養(yǎng)物包括TB標準培養(yǎng)基，均在短時間內(nèi)達到0%的氧飽和度,，表明菌株代謝活性高,。

不同酵母營養(yǎng)素TB樣培養(yǎng)基的產(chǎn)物生成：

通過將IPTG 添加到培養(yǎng)物中來誘導 T7 聚合酶的表達促進黃素熒光蛋白的生成,。BioLector使用梅花板為48個培養(yǎng)物提供了獨立的培養(yǎng)空間，因此可測試不同的誘導時間點,。使用自動化工作站整合BioLector后的 RoboLector 系統(tǒng)還可以自動進行培養(yǎng)誘導,。

首先選擇一個固定的誘導時間點。分別為培養(yǎng)啟動后的3小時,、3.75小時和4.5小時,。下圖所示為每種TB樣培養(yǎng)基在誘導時間下所測熒光的平均值。熒光動力學清晰地表明不同培養(yǎng)基有不同的EcFbFP（黃素熒光蛋白）表達水平,。

表現(xiàn)出最強熒光信號的兩個樣本為：ProCel 2,，誘導點為3.75小時；ProCel 5,，誘導點為 3 小時,。經(jīng)過 7.7 小時的培養(yǎng)，ProCel 5 的熒光值達到102.94a.u.,，而ProCel 2 的熒光值達到 101.82 a.u.,。本方法的不足之處在于未比較不同樣本的生物量對蛋白質(zhì)產(chǎn)量的影響。經(jīng)過3小時的培養(yǎng),，一些培養(yǎng)物的OD已達到6,，而其他培養(yǎng)物僅達到3。當誘導具有不同光密度的培養(yǎng)物時,，可能會對在每種酵母營養(yǎng)素上生長的實驗大腸桿菌的蛋白質(zhì)生產(chǎn)性能造成誤解,。

3.3.png

鑒于此，我們采用了一種新方法,，將誘導點與生物量信號耦合,。使用BioLector的信號驅(qū)動RoboLector，依賴于特定生物量的誘導對于每個單獨的孔都是可行的,。為自動化工作站設置3,、6或8的OD目標值，以根據(jù)孔內(nèi)培養(yǎng)物的生長動力學自動添加IPTG以誘導蛋白質(zhì)生產(chǎn),。

如下圖所示,，ProCel 2表現(xiàn)最佳，最終值為 146.23 a.u.,，培養(yǎng)時間是 12.3 小時,；ProCel 5表現(xiàn)次之，最終值為138.1 a.u.,。與之前進行的一系列實驗相比,，本實驗中的排名與在特定時間點進行誘導的實驗不同。這一觀察證明了最佳工藝條件的重要性，并使這些條件具有可比性,。此處數(shù)據(jù)表明：與之前的實驗相比,，本實驗中的熒光值更高。正如該領域諸多論文中所強調(diào)的那樣,，誘導時間確實是一個關鍵參數(shù),。同樣，在優(yōu)化大腸桿菌重組蛋白生產(chǎn)的過程中,，也必須評估誘導劑的濃度,。另外，與對照TB培養(yǎng)基相比,，這里測試的一些酵母氮源產(chǎn)生了更高的重組蛋白產(chǎn)量,。這些結果凸顯了選擇培養(yǎng)基成分的重要性，這些成分能夠在特定的生物工藝中實現(xiàn)高而穩(wěn)定的產(chǎn)量,。

3.4.png

結論

通過BioLector系統(tǒng),，貝克曼庫爾特可為用戶提供適用于各種應用領域的高通量篩選平臺。其獨特的梅花形微孔板尤其適用于好氧培養(yǎng),，如同實驗室生物反應器,，BioLector系統(tǒng)通過非侵入式傳感器使客戶能夠獲取更多的在線測量參數(shù),。正如本應用,，通過BioLector系統(tǒng)可輕松實現(xiàn)培養(yǎng)基的篩選，整合自動化工作站的RoboLector,，還可實現(xiàn)更多功能,。補料、pH調(diào)控以及文中所述的誘導功能,，所有這些均可在小規(guī)模實驗中實現(xiàn),，幫助客戶同時兼顧成本和效率。

3.5.png