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【知識庫】DSC vs DSF技術大比拼,，誰更勝一籌

馬爾文帕納科 2025-02-19 | 閱讀：1654

本文對比差式掃描量熱法（DSC）與差式掃描熒光法（DSF）兩種表征生物大分子高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性常用技術，幫助您了解兩種技術的異同點,，在評估各類生物大分子的穩(wěn)定性時可以選擇合適的分析工具,。

評估生物大分子的穩(wěn)定性至關重要，因為這直接關系到其在藥物開發(fā)、疾病診斷,、治療以及基礎生物學研究中的應用前景和實際效能,。穩(wěn)定性的評估能夠確保生物大分子在制備、存儲,、運輸及應用過程中保持其結(jié)構(gòu)和功能,，從而發(fā)揮預期的生物學活性，提高生物產(chǎn)品的療效和安全性,。此外,，穩(wěn)定性數(shù)據(jù)對于優(yōu)化生物大分子的生產(chǎn)和純化過程,、延長其貨架壽命,、減少成本以及推動科學研究的深入都有著不可或缺的作用,。

在生物技術藥物開發(fā)的“質(zhì)量源于設計”(QbD) 方法中,，穩(wěn)定性表征是所有候選藥物的“開發(fā)可行性”和“成藥性”評估以及流程開發(fā)和生產(chǎn)的一部分,。穩(wěn)定性數(shù)據(jù)還整合到用于生產(chǎn)支持,、生物技術藥物可比性和生物相似性評估的高級結(jié)構(gòu) (HOS) 表征和“指紋圖譜”中,。

由于生物大分子結(jié)構(gòu)十分復雜,，生物物理工具在生物制藥產(chǎn)品的完全表征中非常重要,。評估生物大分子穩(wěn)定性的生物物理工具多種多樣,，其中差示掃描量熱法（DSC）與差示掃描熒光法（DSF）是表征生物大分子高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的常用技術，本文主要聚焦兩種技術的異同點,，旨在幫助大家選擇合適的技術評估各類生物大分子的穩(wěn)定性。

DSC 與 DSF,，一字之差,，大有不同

01丨測試原理

DSC：溶液中生物大分子以恒定加熱速率由自然（折疊）到變性（展開），此過程涉及非共價鍵的斷裂為吸熱過程,，DSC可以實時監(jiān)測生物分子隨溫度變化而發(fā)生的熱容（C_p）改變,，通過對數(shù)據(jù)的處理（如積分）可以獲取如T_m值,、T_onset,、ΔH,、ΔC_p等熱力學信息,。

DSF：溶液中生物大分子以恒定加熱速率/不同變性劑條件下由自然（折疊）到變性（展開）,，DSF可以實時監(jiān)測由于色氨酸從疏水到親水環(huán)境所導致的發(fā)射波長改變/由于疏水區(qū)域暴露和環(huán)境敏感的疏水染料結(jié)合導致的熒光變化，進而獲取T_m,、T_onset等參數(shù),。

02丨適用樣品類型

DSC：由于DSC是監(jiān)測維系生物分子高級結(jié)構(gòu)非共價鍵斷裂的熱量吸收，所以對于蛋白,、核酸、脂質(zhì)等各類分子都適用,。

DSF：由于DSF是監(jiān)測色氨酸或疏水區(qū)暴露所引起的發(fā)射波長或熒光信號的變化,，所以測試樣品需有豐富的色氨酸/疏水區(qū)，DSF僅適用某些蛋白樣品,，不適用于核酸,、脂質(zhì)等樣品。若測試前蛋白已有部分變性（疏水區(qū)暴露）或樣品中含有去垢劑,，則會造成較強的背景熒光,。

03丨相關參數(shù)含義（T_m、ΔH_cal）

DSC：通過DSC測試所得到的T_m（熱轉(zhuǎn)變中點溫度）為體系中50%生物分子變性對應的溫度,，即峰值所對應的溫度,；ΔH_cal為每摩爾蛋白變性所吸收的熱量，一般用于衡量體系中生物分子的活性含量,。

DSF：通過DSF測試得到的T_m值為體系中50%色氨酸/疏水區(qū)暴露時所對應的溫度,，色氨酸/疏水區(qū)的暴露無法真實的反應蛋白變性過程，同時無法獲得ΔH等樣品活性信息,。

04丨應用

DSC：由于DSC具有良好的重復性,，適合批間一致性分析和生物相似性打分分析,；同時DSC具有結(jié)構(gòu)域級分辨率（可區(qū)分抗體CH2、CH3,、Fab區(qū)域）,，適用于抗體等多個結(jié)構(gòu)域樣品的穩(wěn)定性評估。

DSF：DSF的重復性較差,，難以進行定量分析,，但分析速度較快，適合穩(wěn)定性的快速初步篩選,。

05丨DSC 應用示例

DSC在核酸分析中的應用

與傳統(tǒng)的小分子藥物和抗體藥物相比,，核酸藥物可針對不可成藥靶點、無需復雜蛋白生產(chǎn)工藝,、具有設計簡便,、研發(fā)周期短、靶向特異性強,、治療領域廣泛和長效性等優(yōu)點,，目前在遺傳疾病、腫瘤,、病毒感染等疾病的治療上應用廣泛,，有望成為繼小分子藥物和抗體藥物后的第三大類藥物。然而,，由于核酸藥物本身攜帶負電,、容易降解等問題，導致其穩(wěn)定性差,、半衰期短,、遞送效率低，因此需要經(jīng)過化學修飾或者是遞送系統(tǒng)達到長期有效的治療效果,。DSC可以非常靈敏的反應出核酸化學修飾前后穩(wěn)定性的差異,，然而其他穩(wěn)定性分析技術可能無法反應出這些微小的變化。

DSC用于分析鎖核酸（LNA）摻入核酸的影響

鎖核酸（LNA）是一種經(jīng)過修飾的RNA,，LNA中一部分核糖上的2‘與4’碳連結(jié)在一起,，降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，進而增強磷酸鹽骨架的局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,。該應用利用DSC技術研究了LNA的摻入對DNA,、RNA異源雙鏈體雜交熱力學的影響。LNA修飾后,，峰圖明顯向右偏移,；同時，隨著LNA修飾個數(shù)的增加,，Tm值逐漸升高,，表示雜交體的穩(wěn)定性因LNA的摻入變得更加穩(wěn)定,。

DSC用于表征mRNA-LNP

通過PEAQ-DSC提供的LNP熱力學指紋圖譜，可以對比游離mRNA,、mRNA-LNP以及LNP的穩(wěn)定性變化（圖2）,。從圖中來看，mRNA組裝于LNP之后,，T_m增大,，表明mRNA-lipid產(chǎn)生相互作用之后，能穩(wěn)定彼此結(jié)構(gòu),，使得mRNA-LNP組裝更穩(wěn)定,。