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【AAV熱點應(yīng)用】Zetasizer精準表征rAAV顆粒粒徑及衣殼滴度

馬爾文帕納科 2022-06-09 | 閱讀：2375

腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成員之一,。其直徑約為20-26nm,，含有4.7kb左右的線狀單鏈DNA。重組腺相關(guān)病毒載體（recombination AAV, rAAV）則是在非致病的野生型AAV基礎(chǔ)上改造而成的,，因其具有：安全性高,、免疫原性低；宿主細胞范圍廣（對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力）,；體內(nèi)表達時間長,；血清型眾多，且具有組織特異性等特點被廣泛用于基因治療,、疫苗等研究,、應(yīng)用領(lǐng)域^[^1]。

在rAAV的生產(chǎn)工藝中,，有無團聚體（aggregate）,，以及衣殼滴度（titer）的高低是重點考察的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）^[2]，Zetasizer納米粒度儀通過對rAAV顆粒的粒徑及衣殼滴度的表征,，快速實現(xiàn)該CQAs的鑒定,。

納米粒度電位儀

馬爾文帕納科 Zetasizer Ultra

材料和方法

將兩種不同生產(chǎn)批次的rAAV分別用緩沖液稀釋至合適的濃度，利用Zetasizer Ultra-Red （Malvern Panalytical Ltd.）以及小體積石英比色皿（ZEN2112）進行相應(yīng)的粒徑和滴度測定^[3],。樣品測試體積為20 μL,，rAAV折射率,、吸收率分別設(shè)置為1.45和0.001，緩沖液的散射光強度測定為80 kcps,。

結(jié)果

通過多角度動態(tài)光散射（multi-angle DLS, MADLS）技術(shù),，我們分別對兩種批次的rAAV粒度大小及分布進行表征（圖1、3）,?？梢钥吹剑?的rAAV只有一個粒徑分布峰,，其值大小為28.2 nm，說明體系中沒有團聚體產(chǎn)生,，而批次2的rAAV則呈現(xiàn)出3個粒徑分布峰,，分別位于28.2、150.9以及430.6 nm,，這說明體系中除了rAAV單體,，還有團聚體產(chǎn)生。

此外,，基于MADLS技術(shù)得到的顆粒的準確粒徑分布圖,，我們還能得到對應(yīng)尺寸的衣殼滴度（圖2、4）,。

圖1,，批次1 rAA的光強粒徑分布圖

圖2，批次1的衣殼滴度

圖3,，批次2 rAA的光強粒徑分布圖

圖4,，批次2的衣殼滴度

參考文獻

1. Mendell J R, Al-Zaidy S A, Rodino-Klapac L R, et al. Current Clinical Applications of in vivo Gene Therapy with AAVs. Molecular Therapy, 2021, 29 (2), 464-488.

2. Gimpel A L, Katsikis G, Sha S, et al. Analytical Methods for Process and Product Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus-based Gene Therapies. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2021, 20, 740-754.

3. Cole L, Fernandes D, Hussain M T, et al. Characterization of Recombinant Adeno-Associated Viruses (rAAVs) for Gene Therapy Using Orthogonal Techniques. Pharmaceutics, 2021, 13, 586.

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