共振質(zhì)量測試法在生物制藥開發(fā)中的應(yīng)用
作者：Lisa Newey-Keane博士,，馬爾文儀器生物制藥產(chǎn)品經(jīng)理
預(yù)測和測量蛋白質(zhì)聚集，是生物制藥配方中的一個重大難題。Lisa Newey-Keane博士描述了一種新型分析方法,，可以方便地研究蛋白質(zhì)的聚集。
由于在藥物研發(fā)總體經(jīng)費(fèi)支出中,，生物分子研究工作所占的比重越來越大,，因此分析測試在迅速發(fā)展的生物制藥行業(yè)受到廣泛關(guān)注。這些分子開發(fā)不僅成本高昂,，而且受到嚴(yán)格監(jiān)管,，所以急需更適合、更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆治鰷y量方法,。很多業(yè)內(nèi)人士都提到,，分析瓶頸是一個很令人擔(dān)心的問題，可能會限制藥物的開發(fā),。
與小分子藥物不同,，蛋白質(zhì)制劑是非合成或非結(jié)晶的，且本質(zhì)上是不均勻的,。正因?yàn)槿绱�,，對生物療法的純度和效力做出判定，要比對非生物分子�?fù)雜得多,。例如,，雜質(zhì)來源繁多，包括以聚集體、錯誤折疊構(gòu)象,，或是以完全變性結(jié)構(gòu)形式存在的生物分子,。因此，用于保證和控制質(zhì)量并提供預(yù)配方和配方必要數(shù)據(jù)所需的分析技術(shù)與制藥業(yè)中的用于小分子藥物的分析技術(shù)完全不同,。這種復(fù)雜性和多變性,，不僅給制造商，同樣也給監(jiān)管機(jī)構(gòu)帶來了許多新的挑戰(zhàn),。
挑選合適的候選分子會在其它分析中涉及各種物理化學(xué)測試過程,，以排除那些有可能成為下游“問題分子”的分子。其中一個需要回答的最重要的問題是,，這些分子將會在配方中有怎樣的表現(xiàn),。而值得關(guān)注的重要領(lǐng)域是蛋白質(zhì)聚集體，以及聚集可能引發(fā)的免疫反應(yīng),。監(jiān)管機(jī)構(gòu)已經(jīng)明確表達(dá)了對直徑為0.2微米至2微米的蛋白質(zhì)聚集體造成的潛在免疫原性的關(guān)注，但現(xiàn)有的粒徑測定技術(shù),，尚不足以提供這一范圍的量化數(shù)據(jù),。它們可以讓你知道有這種粒徑的粒子存在，但無法確定存在的數(shù)量,。被應(yīng)用于馬爾文阿基米德系統(tǒng)的諧振質(zhì)量測定（RMM ）技術(shù)能彌補(bǔ)這一缺陷,，因?yàn)樗粌H可以進(jìn)行粒徑測量，更重要的是能對直徑為50納米 - 5微米的粒子進(jìn)行計數(shù),。
技術(shù)簡介
共振質(zhì)量測量主要是依靠一個可以檢測質(zhì)量變化的機(jī)械共振結(jié)構(gòu),。質(zhì)量增加或減少，可以使結(jié)構(gòu)的共振頻率上升或下降,。由于可對頻率進(jìn)行非常精確的測定,，這就為測量質(zhì)量提供了基礎(chǔ)。為了測量懸浮在液體上的微小顆粒的質(zhì)量,，共振器內(nèi)置了微流體通道,。當(dāng)懸浮顆粒通過該結(jié)構(gòu)時，它會改變共振器的整體質(zhì)量,，由此改變其共振頻率,。
通過測量共振頻率對基準(zhǔn)線的偏移，可以實(shí)現(xiàn)對粒子質(zhì)量的測量,。對于具有上浮力的微粒,，如油滴（見下文），則可以觀測到相反的效果,，共振頻率會相對于基準(zhǔn)線發(fā)生正偏移,。
采用共振質(zhì)譜測量非常小的顆粒，需要使用自身質(zhì)量很小的共振器。在馬爾文阿基米德系統(tǒng)中,，MEMS（微機(jī)電系統(tǒng)）傳感器能滿足這一要求,。每個傳感器芯片包括一個微流體網(wǎng)絡(luò)和一個微小的懸臂，以一個特定的頻率發(fā)生共振,。懸臂中內(nèi)置一個微流體通道,。當(dāng)儀器中的流體系統(tǒng)將樣品推送經(jīng)過通道時，懸臂的共振頻率會發(fā)生變化,。共振頻率的變化通過激光測量,，先聚焦到懸臂的頂端，然后將其發(fā)送到一個分離光電二極管探測器,。
每個粒子穿過傳感器都會引起一次共振頻率的變化,，從而得到對樣品中單個顆粒浮力質(zhì)量精準(zhǔn)的測量，無論這個數(shù)據(jù)是正是負(fù),。通過這樣的測量,，可以計算出粒子的質(zhì)量、粒徑（等效球）以及表面積,。同時也可對樣品濃度,、密度、體積和多分散性進(jìn)行整體測量,。
蛋白質(zhì)聚集體的定量測量
起初,，蛋白質(zhì)聚集體處于二聚體水平，此后直徑一路攀升到數(shù)十微米,，高于這一范圍上部的聚集體通常采用流量式顯微鏡來測量,。共振質(zhì)量測量可應(yīng)用于低于流式顯微鏡測量范圍的領(lǐng)域，包括那些粒徑在亞微米至幾微米,、以及不易通過其他方法評估定量評估測量的粒徑,。這也是免疫原性的影響之處，以及新的監(jiān)管要求關(guān)注的地方,。
使用RMM測量得出,，粒徑大于300納米的聚集體濃度為每毫升4×106。因?yàn)闇y量是基于質(zhì)量的,，粒度分布可以用形成每種聚集體的蛋白質(zhì)分子（已知質(zhì)量的）數(shù)量來表示,。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，從300nm到1μm范圍內(nèi)聚集體的濃度在增長,。這種尺寸的聚集體出現(xiàn)10倍的增加,，大致對應(yīng)一條聚集體級聯(lián)，而亞微米聚集體的濃度與壓力下制劑質(zhì)量的不好有關(guān),。
檢測污染物
蛋白質(zhì)制劑分析中另一個流行的課題是硅油,，它通常作為潤滑劑,，存在于盛制劑的注射器和容器中。硅油常常會混入制劑中,，形成與聚集體大小接近的油滴,。但主要問題不是生物相容性，因?yàn)楣栌偷瓮ǔ１徽J(rèn)為是安全的,。更大的問題在于,，在某些測量方法中，油滴會被誤認(rèn)為是蛋白聚集體,，因此有可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性,。
RMM可以通過浮力測量將硅油滴與蛋白質(zhì)聚集體區(qū)分開來。密度大于懸浮緩沖液的聚集體,，是用頻率軌跡中的負(fù)峰值來表示,。
硅油滴的密度一般比緩沖液的密度低，會在頻率軌跡上形成正峰值,，這是因?yàn)樗鼈兊拇嬖诮档土藗鞲衅鞯恼w質(zhì)量,，從而提高傳感器的共振頻率。每一組都提供了單獨(dú)的分布情況,。
今日技術(shù)
常規(guī)分析儀器使用過程中,， RMM技術(shù)應(yīng)用和推行成功至為關(guān)鍵的原因，在于它解決了蛋白質(zhì)聚集測量中的關(guān)鍵粒度范圍這一問題,。同樣重要的是，在處理小劑量貴重材料時,，只需100 μL粘度達(dá)到100 cP的樣品,，且無需進(jìn)行樣品制備，即可進(jìn)行測量,。
由于能對50納米至5微米尺寸范圍內(nèi)的顆粒進(jìn)行檢測并精確計數(shù),，以及對浮力質(zhì)量、干質(zhì)量和大小進(jìn)行可靠測量,，共振質(zhì)譜測量成為蛋白特性鑒定極具吸引力的方案,。有關(guān)配方和穩(wěn)定性的定量信息，可被轉(zhuǎn)化為對效能及其穩(wěn)定性的信息,。目前,，RMM已經(jīng)被用于生物制劑早期開發(fā)階段，對聚集體進(jìn)行檢測和量化,，這實(shí)現(xiàn)了“發(fā)現(xiàn)越早,，代價越小”的理念。
馬爾文公司全新的生物科學(xué)開發(fā)計劃
在傳統(tǒng)模式下,，要將一種分析儀器推向市場,，并使其成為完善的最終產(chǎn)品，往往要耗時數(shù)年。但這種模式卻完全不適用于生物制藥部門,，因?yàn)樗荒芑卮饡r過境遷的問題,。處于生物制藥研究最前沿的研究人員，需要能解決當(dāng)前問題的分析工具,；而對供應(yīng)商的挑戰(zhàn),，則在于需要對未知領(lǐng)域進(jìn)行預(yù)測，在這些領(lǐng)域,，快速變化的分析和監(jiān)管要求不斷考驗(yàn)相關(guān)參與者,。因此有必要了解什么是可以測量的，什么樣的測量結(jié)果可以提供質(zhì)量方面的有價預(yù)測信息,，并預(yù)見未來所需要的測量,。
馬爾文通過創(chuàng)建生物科學(xué)開發(fā)計劃，助力生物科學(xué)行業(yè)的飛速發(fā)展,。該計劃旨在跟上生物制藥技術(shù)快速的發(fā)展步伐,，并肩負(fù)起作為分析儀器制造商的責(zé)任，即針對迅速發(fā)展的分析和監(jiān)管挑戰(zhàn),，快速提供令人信服的解決方案,。獲得成功的關(guān)鍵是以高度自信、開放的態(tài)度,，展開高層次技術(shù)開發(fā)合作,，并建立靈活的技術(shù)和產(chǎn)品開發(fā)流程，對確認(rèn)的分析需求保持絕對的專注,。
盡管生物科學(xué)開發(fā)計劃是馬爾文組織機(jī)構(gòu)的一個組成部分,，其運(yùn)營卻是在華盛頓特區(qū)附近的工廠中開展。該計劃由馬爾文公司首席技術(shù)官E Neil Lewis 博士負(fù)責(zé),，他領(lǐng)導(dǎo)著一支由科學(xué)家,、工程師和業(yè)務(wù)開發(fā)人員組成的專家小組。這些成員雖然分處各地,，卻又緊密聯(lián)系于馬爾文核心團(tuán)隊(duì)之中,。他們專注于生物制藥行業(yè)的要求，尤其是有關(guān)配方和產(chǎn)品開發(fā)的生物化學(xué)和生物物理表征的需求,。
這一對市場反應(yīng)迅速,、經(jīng)費(fèi)充足且目標(biāo)明確的計劃，將會促進(jìn)生物制藥企業(yè),、技術(shù)創(chuàng)新者和領(lǐng)先學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)之間的密切合作,。通過建立這種互惠互利的關(guān)系，馬爾文可以實(shí)時了解新興產(chǎn)業(yè)的要求,，并作出快速響應(yīng),，生物制藥部門則可以盡早介入,，并幫助設(shè)計它所亟需的前沿技術(shù)。該項(xiàng)合作的第一項(xiàng)成果,，是達(dá)成了將馬爾文阿基米德系統(tǒng)推向市場的協(xié)議,。隨著技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，今年會有完全成熟的產(chǎn)品推出,。
欲了解有關(guān)馬爾文生物科學(xué)發(fā)展計劃的進(jìn)一步信息,，敬請聯(lián)系E. Neil Lewis博士
