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在顯微成像領域,，特別是免疫熒光樣本成像中，當標記熒光素過多時,，各個熒光素光譜發(fā)生重疊,，采用傳統(tǒng)濾光片成像,，單個通道會采集到多個熒光信號，發(fā)生通道串色現(xiàn)象,，無法獲取純凈的單通道圖像,。TissueGnostics公司利用液晶可調(diào)諧濾光器將多光譜成像技術應用于顯微成像，對樣本進行多光譜成像,，即λ-stack成像,，巧妙解決了通道串色問題。

TissueFAXS SPECTRA PLUS

正置系統(tǒng)

液晶可調(diào)諧濾光器成像元件（ Liquid Crystal Tunable Filters）：

可濾光光范圍：420nm-730nm

步徑精度：1nm

在相同條件下,，每一個熒光素分子的發(fā)射光譜,、不同波長位置的熒光強度比值都是固定的，這就為光譜拆分提供了理論基礎,。在明確所有標記熒光光譜的情況下,，即可將其作為參照，進行運算得知多色標記樣本中光信號分別是來源于哪一個熒光素及其所占比例,，進而通過信號拆分得到每一個熒光純凈的圖像數(shù)據(jù),。

光譜拆分技術解決了常規(guī)濾光片成像方式存在的通道串色問題，為多色標記成像提供了可能和準確的處理方法,。

除此之外,，免疫熒光實驗中，自發(fā)熒光是非常常見的干擾,，它不僅影響標記熒光強度準確定量,，同時也會掩蓋弱的熒光信號。而且同組織內(nèi)自發(fā)熒光的物質來源是基本相同的,，所以自發(fā)熒光可以等同看作一個“熒光素”,。在獲取其光譜后，同樣可作為參照,，將自發(fā)熒光從樣本中拆解出來,。

免疫組化實驗中用到的蘇木素、DAB等色素和熒光素類似,，每個色素都具有特異性吸收光譜,，也可使用光譜拆分的方式將多色標記組化樣本進行拆分處理，提高明場免疫組化標記數(shù)目,。

該圖為熒光ECFP,， EGFP和EYFP的獨立和重疊光譜。取得每個熒光素和自發(fā)熒光的光譜之后,，即可將它們導入StrataQuest Unmixing Engine作為參照進行多色標記樣本信號拆分,。

利用多光譜成像技術對每個熒光素進行特定波長范圍成像，即λ-stack成像,，快速獲取所有單標熒光樣本參照光譜,，同樣空白樣本自發(fā)熒光可等同視為一個“標記熒光”,，獲取其參照光譜。

實現(xiàn)準確光譜拆分,，每一個熒光,、自發(fā)熒光的參考光譜都是必須的。