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農(nóng)業(yè)部指定非洲豬瘟試劑盒

核酸DNA提取試劑盒（柱膜法）使用說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：病毒DNA提取試劑盒

英文名稱：Extraction Kit for Virus DNA

【預(yù)期用途】

本試劑盒主要用于疑似病毒等病原感染抗凝血,、血淸,、拭子、組織,、飼料及環(huán)境中的病毒DNA的提取,，純化的核酸可適用于各種常規(guī)操作及PCR試驗(yàn)。

【試劑盒組分】

I,、試劑盒組成及貯藏條件

　　2,、 保存條件及有效期：室溫下保存，有效期12個(gè)月.

　　3,、 需自備材料：無水乙醇,、1.5 mL無菌離心管、1.5 mL無菌離心管(長臂型),、生理鹽水,、研缽、無菌

　　1mL,， 2OOuL,、10uL槍頭、記號筆等,。

　　【操作步驟】

　　一,、樣品制備

　　1、 血液樣品：抗凝血樣品置離心管中,，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘,，取上層血漿;非抗凝血樣品置離心 管中，待凝固后,，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘,，取上層血清，置于滅菌離心管中,，編號待檢,。

　　2、 組織樣品：采集脾臟,、肝臟,、淋巴結(jié)、扁桃體等病變組織樣品0.1 g.組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨,，加入1 mL生理鹽水混勻,，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘,，取上清于滅菌離心骨屮，編號待檢,。

　　3,、 口腔液：進(jìn)食前用拭子/口腔液采集袋或自制棉線綁紗布團(tuán)吸引動(dòng)物咀嚼，收集口腔液大于 500uL,， 8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘,，取上清于滅菌離心管中，編號待檢,。

　　4,、 飼料：取適量研磨后的飼料(約0.2g)，放入含1 mL生理鹽水或PBS(PH為7.4)緩沖液的2 mL EP 管屮,，振蕩混勻,，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取上清于滅菌離心管中,，編號待檢.

　　5,、 灰塵：用無菌棉簽蘸取適量環(huán)境表面上的灰塵，放入含1 mL生理鹽水或PBS(PH為7.4)緩沖液的2 mL EP管中,，振蕩混勻,，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取上清于滅菌離心管中,，編號待檢,。

　　二、DNA的提取

　　1,、取裂解液200uL加入無核酸酶1.5 mL離心曾屮,，分別加入血漿/血清/組織液等樣品液200uL. 震蕩混勻10秒或顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘(如果室內(nèi)溫度較低時(shí).需放置25C水浴溫育),，再加入200uL無水乙醇,，顛倒混勻10秒;若樣品渾濁則先12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘處理，取上清液,，以避免堵塞柱子;

　　2,、 將液體轉(zhuǎn)入套有收集管的吸附柱中， 12000rpm離心1分鐘：

　　3,、 棄收集管液體,，向吸附柱中加600uL洗液I ， 12000 rpm離心1分鐘;

　　4,、 棄收集管液體,，向吸附柱中加600uL洗液II， 12000 rpm離心I分鐘;

　　5,、 棄收集管液體,，12000 rpm離心2分鐘,，以徹底去除殘留洗液;

　　6、將吸附柱轉(zhuǎn)入新的無核酸酸1.5mLEP管(長臀型)中,，向柱中央滴加50 uL洗脫液,，靜置1分鐘， 12000 rpm離心1分鐘,，EP管中液體即為病毒DNA,。

　　【注意事項(xiàng)】

　　1、 實(shí)驗(yàn)前諾仔細(xì)閱讀本試劑盒說明書,，嚴(yán)格按照操作步驟執(zhí)行.在操作過程中對時(shí)間,、試劑體積等 粘確控制可以獲得**的結(jié)果。

　　2,， 樣本應(yīng)新鮮采集使用,，或低溫運(yùn)輸儲存;

　　3， 樣本具有潛在感染風(fēng)險(xiǎn),，核酸的提取應(yīng)在核酸提取實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜中進(jìn)行,。

　　4、 核酸提取冇關(guān)耗材確保高溫滅菌,，提取后核酸盡快進(jìn)入下一步試驗(yàn)或冷凍保存待用。

　　5,， 試劑使用前應(yīng)混合均勻,，試劑具有一定腐蝕性，使用時(shí)請戴手套,、口罩做好防護(hù),。

　　6. 低溫下裂解液出現(xiàn)結(jié)晶數(shù)屬正常現(xiàn)象,，可在60°C水浴加熱助溶后使用,。

　　7、 實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)及時(shí)收集,，遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行無害化處理,。

　　僅供獸醫(yī)診斷使用

非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒說明書

【獸藥名稱】

通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒

漢語拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

英文名稱：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

商品名稱：無

【主要成分與含量】試劑盒中含有如下組分:

　　【用法與判定】

　　1 用法

　　1.1待檢樣品釆集,、保存及運(yùn)輸

　　1.1.1樣品釆集

　　(1) 活豬樣品 無菌采集抗凝血或血清5mL

　　(2) 病死豬剖檢樣品或屠宰場剖檢樣品 無菌采集死豬的牌,、肺、腎,、扁桃體,、淋巴結(jié)、肌 肉等組織樣品,。2?8°C低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室用于檢測,。

　　(3) 病豬污染的周邊環(huán)境 采集與病豬相關(guān)場所的糞便、飼料,、污水樣品,。2?8°C低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室用于檢測。

　　1.1.2樣品保存 采集的樣品在2?8°C保存應(yīng)不超過24小時(shí),，-70°C條件下保存,，避免反復(fù)凍 融。

　　1.1.3樣品運(yùn)輸泡沫箱加冰袋后密封進(jìn)行運(yùn)輸,。包裝和運(yùn)輸應(yīng)符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《高致病性動(dòng) 物病原微生物菌(毒)種或者樣品運(yùn)輸包裝規(guī)范》和交通運(yùn)輸部門關(guān)于危險(xiǎn)品運(yùn)輸管理的有關(guān)規(guī)定,。

　　1.2樣品處理

　　1.2.1血液樣品處理 抗凝血樣品置于離心管中，8000 r/min離心2分鐘取上層血漿,，編號待 檢,。非抗凝血樣品置于離心管中，待凝固后,，8000 r/min離心2分鐘取200μL上層血清,，編號待檢。

　　1.2.2組織樣品處理取適量脾臟,、肝臟,、淋巴結(jié)、扁桃體,、肌肉等組織,，置于研磨器或研磨 管中研磨，再加適量生理鹽水混勻,，制成約10%的組織勻漿,，8000 r/min離心2分鐘，取200μL上 清于RNase/DNase-free無菌離心管中,，編號備用,。

　　1.2.3環(huán)境樣品處理

　　1.2.3.1糞便、飼料樣品處理方法取適量的糞便,、飼料放入盛有PBS緩沖液的研磨管中研磨 混勻,，制成約10%的勻漿液.8000 r/min離心2分鐘，取200μL上清于RNase/DNase-free無菌離心 管中,，編號備用,。

　　1.2.3.2污水樣品處理方法 直接取200μL污水進(jìn)行核酸提取,。

　　1.3病毒核酸的提取用磁珠法或柱式法進(jìn)行DNA核酸提取。

　　1.4熒光PCR反應(yīng)：

　　1.4.1從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液,、酶混合液,，室溫融化后，2000 r/min離心5秒,。設(shè)被 檢樣品,、陽性對照和陰性對照總和為n，則反應(yīng)體系配制如下：

　　試劑 體系

　　PCR 反應(yīng)液 17× (n+1) μL

　　酶混合液 3× (n+1) μL

　　1.4.2在新的RNase/DNase-fire 1.5 ml離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時(shí)離心,。按照20μL/ 管分裝量將試劑分裝至熒光PCR反應(yīng)管。

　　1.4.3在上述制備好的熒光PCR反應(yīng)管中分別加入陰性對照,、陽性對照各5μL,、處理好的待測 核酸各5μL，終體積25μL/管,，蓋好熒光PCR反應(yīng)管蓋,，混勻后瞬時(shí)離心，轉(zhuǎn)移到熒光PCR儀器 上,。

　　144將PCR反應(yīng)管放置在熒光PCR儀樣品槽中,，在熒光PCR儀上運(yùn)行以下程序：

　　熒光通道選擇FAM,，在PCR擴(kuò)增階段每個(gè)循環(huán)的55C時(shí)采集熒光信號。設(shè)置擴(kuò)增體系為25卩I,， 同時(shí)要選擇passive reference和quencher為none的模式。(注：若熒光PCR儀(如AB17500)按說明 書中的反應(yīng)程序設(shè)置后因持溫時(shí)間短無法運(yùn)行,，可將預(yù)擴(kuò)增和PCR擴(kuò)增條件變更為95C： 5秒 55°C： 30 秒)

　　2結(jié)果判定

　　2.1試驗(yàn)有效性判定

　　陽性對照有典型擴(kuò)增曲線且Ct值≤30.且陰性對照無Cl值或無擴(kuò)增曲線,，線形為直線或輕微 斜線，無指數(shù)增長期,。則判試驗(yàn)結(jié)果有效,。否則，此次試驗(yàn)視為無效,。

　　2.2樣品判定

　　2.2.1陽性：樣本檢測結(jié)果Ct值≤35且有明顯指數(shù)增長期,，判定檢出非洲豬瘟病毒核酸。

　　2.2.2可疑：樣本檢測結(jié)果Ct值在35?38范圍內(nèi),。此時(shí)應(yīng)對樣本進(jìn)行重復(fù)檢測,，如果重復(fù)實(shí)驗(yàn) 結(jié)果Ct值仍在35?38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期.則判定為陽性,，否則為陰性,。

　　2.2.3陰性：樣本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值,，判定未檢出非洲豬瘟病毒核酸。

　　【注意事項(xiàng)】(1)實(shí)驗(yàn)前請仔細(xì)閱讀本試劑盒說明書,，嚴(yán)格按照操作步驟執(zhí)行,，在操作過 程中對時(shí)間、試劑體積等精確控制可以獲得**的結(jié)果,。

　　(2) 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)規(guī)定分區(qū)管理,，依照配液區(qū)-模板提取區(qū)-擴(kuò)增區(qū)-分析區(qū)順序 進(jìn)行基因檢測。各區(qū)間人員,、器材,、試劑及空氣流向應(yīng)有嚴(yán)格要求。

　　(3) 核酸提取有關(guān)耗村確保潔凈,、無DNase/RNase,，提取過程盡量低溫、快速,，完成后進(jìn)入 下一步實(shí)驗(yàn)或凍保,。

　　(4) 對于頂部采光儀器要帶新的一次性PE手套對熒光PCR管封蓋，對于底部采光儀

　　器要避免徒手或使用過的手套接觸熒光PCR管底,，檢測過程中使用不帶熒光物質(zhì)一次性乳膠手套,。

　　(5) 凍存試劑使用前應(yīng)于室溫下完全融化，瞬時(shí)離心使液體完全沉于管底,。避免反復(fù)凍融,， 以免影響試劑性能。

　　(6) 樣品,、陽性對照等在使用后及時(shí)封蓋,，.避免組分間及氣溶膠等的污染造成假陽性。

　　(7) 擴(kuò)增產(chǎn)物禁止開蓋,，實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)及時(shí)收集,，遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行無害化處理。

　　【規(guī)格】50頭份/盒

　　【貯藏與有效期】試劑盒置-20°C以下避光保存,，有效期12個(gè)月,。

　　【批準(zhǔn)文號】獸藥生字163668871

　　【生產(chǎn)企業(yè)】鄭州中道生物技術(shù)有限公司

　　僅供獸醫(yī)診斷使用